靶向Galectin-1基因的siRNA真核表达载体构建及鉴定

作者:任东明;王磊;王一羽 刊名:现代肿瘤医学 上传者:任宝宏

【摘要】目的:构建Galectin-1特异性siRNA真核表达载体psilencircle-G1si,转染细胞株U14,下调Galec-tin-1的表达。方法:运用生物信息学技术候选siRNA序列,合成SECs转染U14细胞,以荧光定量PCR快速筛选有效序列;siRNA序列插入siRNA真核表达质粒psilencircle,构建psilencircle-G1si并转染U14细胞,实时荧光定量PCR、Western blot检测Galectin-1表达量。结果:psilencircle-G1si酶切、测序表明与设计一致,实时定量PCR及western blot表明psilecircle-G1si能调低U14细胞Galectin-1的表达。结论:成功构建Ga-lectin-1特异性siRNA真核表达载体psilencircle-Glsi,为进一步研究解除肿瘤细胞反杀伤T细胞的策略奠

全文阅读

半乳糖凝集素(Galectins),是一组富含N-乙酰基乳糖结合域的糖蛋白家族,已发现14个家族成员,其结构包含一段约135个氨基酸的糖类识别区(Carbohydrate-recognitiondomains,CRD),对-半乳糖苷具有特殊亲和力。半乳糖凝集素-1(Galectin-1)是其成员之一,与细胞间的黏附、细胞周期的调节、凋亡,肿瘤细胞的转化、转移,以及炎症反应有关[1]。与正常细胞比校,肿瘤细胞表面高表达Galectin-1,且表达量与侵入肿瘤组织的活化T细胞的凋亡有关,使肿瘤细胞能逃逸机体对肿瘤细胞的细胞免疫[2]。避免肿瘤细胞通过Galectin-1诱导活化的T细胞凋亡,将可能延缓肿瘤细胞的生长和转移,提高免疫细胞过继疗法的疗效。本研究运用生物信息学技术候选siRNA序列,合成siRNA表达框架(siRNAexpressioncassettes,SECs)[3]以荧光定量PCR快速筛选有效序列,siRNA序列插入siRNA真核表达质粒psilencircle,构建靶向Galectin-1基因的siRNA真核表达载体psilencircle-Glsi转染U14细胞,下调Galectin-1的表达,为进一步研究解除Galectin-1诱导的肿瘤细胞逃逸免疫应答的作用奠定基础。1材料与方法1.1材料1.1.1菌种E.ColiDH5及U14细胞由本实验室保存。1.1.2主要试剂盒及工具酶siRNA表达框架(siRNAex-pressioncassettes,SECs)合成试剂盒linesilenceCompleteRNAiKi、tsiRNA质粒构建试剂盒silencircleCompleteRNAiKit为美国绿阳公司(allelebiotech)产品,含psilencircle4749bp预切载体。PCR纯化试剂盒/DNA纯化试剂盒、质粒中量抽提试剂盒、DNAmarker、IP细胞裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG、BeyoECLWestern检测试剂、显影定影试剂盒、Lipofecter脂质体转染试剂盒为碧云天生物技术研究所产品。Trizol为Invitrogen公司产品;M-MLV逆转录酶为Promega公司产品;DNA聚合酶为Fermentas公司产品;实时荧光定量PCR试剂盒DyNA-moSYBRGreenqPCRKit为Finnzymes公司产品;RPMI1640为Gibco公司产品;小牛血清为杭州四季清公司产品;低分子量蛋白质marker(97,66,43,31,20,14kDa)购自中国科学院上海生物化学研究所;小鼠抗人Galectin-1抗体(WB)为eBioscience公司产品;小鼠抗人GAPDH为联科生物公司产品。1.2方法1.2.1Galectin-1siRNA序列筛选将GeneBank中人Galectin-1序列[NM-002305]输入到http://jura.wi.mit.edu/bioc/siRNAext/进行在线设计[4];把设计的序列输入ht-tp://rnai.cs.unm.edu/tools/,预测有效率,筛选出3条siRNA序列[5],分别命名为si1、si2、si3。并设立与人类基因组无同源性序列5'-GACTTCATAAGGCGCATGC-3',命名为si-c。1.2.2siRNA表达框架的合成[4]根据si1、si2、si3、si-c序列,按LineSilenceTMCompleteRNAiKit说明书设计相应下游引物,引物由上海生工合成。按试剂盒说明合成

参考文献

引证文献

问答

我要提问