靶向卵巢癌HIF-1α基因siRNA真核表达载体的构建及鉴定

作者:邹颖刚;薛惠荣;崔满华 刊名:中国实验诊断学 上传者:徐凤叶

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中国实验诊断学 2010年 8月 第 14卷 第 8期 文章编 号 :1007—4287(2010)08—1265—02 ---— — 1265 ·--—— 靶 向卵巢癌 HIF一1(]c基 因 siRNA真核表达载体 的构建及鉴定 邹颖刚 ,薛惠荣 ,崔满华 (1.吉林大学第二医院 妇产科,吉林 长春 130041;2.解放军第二二二医院 妇产科) RNA干扰 (RNA interference,RN )是生物体 内 普遍存在于 RNA水平上调节基 因表达 的方式⋯1,具 有很强的转录后基 因沉默作用 ,已广泛用于抗肿瘤 的研究中。缺氧诱导 因子一1a表达与肿瘤 的耐药可 能有密切关系[ ,卵巢癌细胞 中亦有 HIF.1a蛋 白的 高表达E3 J,因此抑制卵巢癌细胞 中 HIF.1 基 因的表 达可 能逆 转 肿瘤 耐 药。本 研 究 构 建靶 向卵 巢 癌 HIF—I~siRNA真核表达 载体 pshRNA—HIF,为进一 步 阐明 HIF.1a与卵巢癌耐药 的关系提供基础。 1 材料与方法 1.1 材 料 siRNA模 板 寡 核苷 酸 ,上 海 生工 ;pSuper. / Yleo,OligoEngine公司;Lipofectamine 2000,美国 Invitm— gen公司 ;兔抗人 HIF-la多克隆抗体 ,武汉博士德生 物工程有限公司;兔抗人 l3一actin多克隆抗体 ,美 国 Santa Cruz公司;SKOV3/DDP,吉林省肿瘤医院。 1.2 方法 1.2.1 siRNA及其转录模板 DNA链的设计与合成 (1)RNAi靶位点序列 的设计 :根据人 HIF 1a的 mRNA序列 (U22431),参考 siRNA的设计原则_l J,根 据相关文献_4j,选定 siRNA干扰位点。检索确认 与 HIF.1a以外的人类已知基 因序列无 同源性。 (2)寡核苷酸链的设计 :寡核苷酸链 均为 60 nt, 5 端和 3 端分别含有 BglⅡ和 Hind111的酶切位点 ,末 端加有转录终止信号(5个 T)。与人类无 同源性 的 深海水母 的 RNAi序列作为对照。序列如下 : HIF_1 : Forward:5 .G :【℃CCC TCCAGAGTCAC1m A ACTT— TCAAGAGAAGTFCCA( ACTC1∞ rrrTTTGGAAA.3 Reverse:5 .AGCTrI I℃CA A A A A A [℃CAGAGTCACT. GGAACTFCTC n℃AAAG1] CAG AC I℃1℃G GG一3 Control: Forw ard:5 .G 蜘[℃CCCGA AACC CAAAGTAAC( r *通讯作者 rCAAGAGACCTⅨ AAA .3 Reverse:5 .A( T1 ITI℃CAAAAAGAAACC AAA EA AGCTC11CT AACCTD (3)寡核苷酸链退火连接 。 1.2.2 RNAi质粒的构建 、转化和筛选 。 1.2.3 重组质粒鉴定 (1)酶切鉴定 。(2)测序鉴 定 。阳性 克隆分别命 名为 pshRNA—HIF和 pshRNA— Control。 1.2.4 pshRNA—HIF瞬时转染 SKOV3/DDP细胞 ,转 染 72小 时 后 RT-PCR检 测 HIF.1amRNA 的 表 达 Western blot检测 HIF.1d蛋 白的表达 ,凝胶图像分析 系统测定条带密度 ,以 HIF一1a与 8一actin密度之 比来 表示表达量 ,并计算抑制率 。参照文献 [5]设

参考文献

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