COX基因在斑马鱼胚胎早期发育过程中的表达

作者:韩勇军;吴新荣 刊名:广东药学院学报 上传者:洪伟超

【摘要】目的克隆斑马鱼COX-1、COX-2a基因,研究其在斑马鱼胚胎早期发育中的表达情况。方法提取24 h斑马鱼胚胎的总RNA,制备DIG标记的COX-1、COX-2a RNA反义探针,整胚原位杂交研究COX-1、COX-2a在斑马鱼胚胎早期发育过程中的表达。结果 COX-1在囊胚期和原肠胚期为弥散性表达,18 h集中表达在后部躯干,到24 h,COX-1在输尿管和远端脊索处有表达,24~36 h,头部表达量高,48 hCOX-1的表达弱。COX-2a在原肠胚期前不表达,在10.8 h开始表达,位于前端神经外胚层,在26 h,COX-2a在前脑、小脑和后脑有特异性表达。结论明确了COX-1、COX-2a基因在斑马鱼胚胎发育过程中的表达模式,为研究该基因功能提供了一定的理论基础。

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环氧化酶又称为前列腺素内过氧化合成酶、前列腺素H合成酶,是催化花生四烯酸转变为前列腺素的限速酶。哺乳动物的环氧化酶至少有2种形式:COX-1、COX-2。近年来研究显示,COX-1在卵巢癌[1]、宫颈癌[2]中可存在不同程度的表达上调,COX-1抑制剂具有明显抑制乳腺肿瘤生长的作用。COX-2属于诱导型,静息时不表达,但可以在细胞因子、激素、致癌物质等多种诱导因子的刺激下快速表达,参与多种病理生理过程[3]。斑马鱼(Daniorerio)是近年来崛起的一种模式生物。它的显著优势在于:个体小,便于大批量饲养;产卵量大,胚胎透明,易于观察和操作;体外发育,发育迅速,23d即可完成主要器官的建成;可以方便地进行大规模的诱变和突变型筛选等研究。它已成为脊椎动物胚胎发育遗传学和基因功能研究中理想的模式生物。整胚原位杂交技术是研究斑马鱼发育相关基因的功能和表达模式的一种重要手段。本文通过整胚原位杂交方法分析COX-1、COX-2a在斑马鱼早期胚胎发育过程中的表达情况,为下一步研究该基因的功能提供基础。1材料与方法1.1材料斑马鱼,Tubingen野生型;总RNA提取试剂盒RNAqueous-4PCRKit、PCR引物(上海生工生物工程有限公司);琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(Tiangen);T4DNA连接酶(Promega);pGM-Teasy载体(Promega);大肠杆菌DH5感受态细胞(Tiangen);限制性内切酶NcoI、ApaI(TaKaRa公司);普通质粒小提取试剂盒(Tiangen);ExTaq聚合酶(TaKaRa);DIGRNALabelingMix(Roche);SP6RNAPolymerase(Promega);Anti-Digoxigenin-AP(Roche);NBT、BCIP染色剂(Roche)。1.2方法1.2.1构建系统进化树从生物技术信息网页http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/获取斑马鱼、人、小鼠的COX-1,COX-2a基因,用CLCSequenceViewer6.1软件构建系统进化树。1.2.2提取总RNA收集24hTubingen野生型斑马鱼胚胎,按照RNAqueous-4PCRKit说明进行操作,-70保存。1.2.3RT-PCR扩增将提取的总RNA用随机引物法进行反转录。根据斑马鱼COX-1、COX-2a基因mRNA序列,设计这2个基因的引物,COX-1上游:5'-CTACTGCGAATCCTTGTTGC-3',下游:5'-ACT-GCGGGTTGTATTGAGAA-3',PCR产物大小为1202bp;COX-2a设计为巢式引物,外引物:上游:5'-ATCCTGTTGTCAAGGTCCCA-3',下游:5'-CGATTG-AAAGACTGGTAGCG-3',长度为1028bp;内引物:上游:5'-ATACCTATTACACCCGCACCC-3',下游:5'-TGCTCTCATCATCCCAGTCAG-3',长度为525bp。用cDNA模板扩增,琼脂糖凝胶电泳鉴定,用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收扩增的目的基因。1.2.4克隆PCR产物将回收纯化的COX-1、COX-2aDNA片段连接到Teasy载体上,42热激法转化到感受态DH5中,经氨苄抗性筛选重组质粒克隆。1.2.5菌落PCR鉴定和测序挑取单个菌落进行摇床培养3h,以菌液为模板进行PCR扩增,凝胶电泳检测是否有目的基因;将菌落PCR鉴定有目的基因的重组质粒送到华大基因公司进行测序。1.2.6制备反义mRNA探针将提取纯化的COX

参考文献

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