仔猪大肠杆菌的分离及PCR检测

作者:杨莉;余波;杨茂生;徐景峨;李刚;陈远晟;万廷友;龙玲;段培强;史开志;蒲龄;魏赐开;刘兵;袁廷明;蒲鲁琴;肖拉拉 刊名:中国畜禽种业 上传者:毛燕英

【摘要】猪大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌菌所致的一种仔猪的传染病,严重影响仔猪成活率。其临床表现主要为仔猪腹泻(黄痢、白痢)和水肿病。具有发病迅速、病程较短、发病率和死亡率均高的特点。该病对规模化集约化养猪业危害较大,给猪场带来较大的经济损失。

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交 流 仔猪大肠杆菌的分离及PCR检测 杨莉1余波1杨茂生1徐景峨1李刚1陈远晟2万廷友3 龙玲1段培强1史开志1蒲龄1 魏赐开4 刘兵4袁廷明5蒲鲁琴6肖拉拉6 (1,贵州省畜牧兽医研究所550005; 2袁贵州省贵阳市乌当区农业局畜牧技术服务中心550018; 3袁贵州省大方县动物卫秤星监督所551600; 4袁贵州省黔南州瓮安动物疫病预防控制中心556500; 5,贵州省黔东南州天柱县蓝天镇农业服务中心556603; 6,贵州省大方县动物疫病预防控制中心551600) 猪大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌菌所致的一种仔猪的 传染病,严重影响仔猪成活率。其临床表现主要为仔猪腹泻 (黄痢、白痢)和水肿病。具有发病迅速、病程较短、发病 率和死亡率均髙的特点|1]。该病对规模化集约化养猪业危害 较大,给猪场带来较大的经济损失|2]。笔者于2015~2017年 开展了细菌分离和分子学(PCR方法)工作,为贵州省猪腹 泻和水肿病大肠杆菌的临床鉴定和流行病学调查提供了可靠 保障。 1 材料与方法 1 . 1 材料 1.1.1病料采集 2014耀2017年从贵州省贵阳市、遵义地区、毕节地区、 黔西南州、黔东南州、黔 南 州 等 地 (每个市、州 2~3个 县 ) 养猪场或养殖小区采集仔猪腹泻(黄、白痢)、水肿的病例, 灭菌棉签采集拉稀粪便(肛门),病死猪的肝脏和肠内容物 等 病 料 (低温运送)进行分离病原。 1.1.2试验材料 LB液体培养基、LB琼脂培养基、伊红美蓝培养基、麦 康凯琼脂培养基,三糖铁琼脂培养基,按常规方法制成平板 培养基;细菌生化微量鉴定管(购自杭州天和微生物试剂有 限公司),引物,根 据 GenBank数据库,引物合成由是大连 宝生物工程有限公司,大肠杆菌的通用引物,即 16SrRNA 上弓丨物:5-CTTTCACTCACAAACCAGCAA-3,下弓丨物:5- AAGTCGTAACAAGGTAACCGTAG-3。染料 GoldView 购自北 京塞百盛基因技术有限公司,Dl-2000DNA Marker DNA试剂 盒或煮沸法,聚 合 酶 (2xTaqPCRMasterMix),ddH2O,标准 株,TBE液 ,TAE液 和 1%琼脂糖购自Biowest公司等扩增仪 (德国产),电泳仪,成像系统。 1.2 方法 1.2.1细菌的分离 在待检样品试管内加人1ml无菌生理盐水,充分混匀成 粪悬液。用接种棒从试管中蘸取少许粪悬液,病死猪肝和肠 内容物,分别接种LB液体培养基,恒温培养箱中37益培养 24h 后 ,接种于麦康凯琼脂培养基,麦康凯琼脂平板培养基 上多方向分区划线,移人恒温培养箱中37益培养24h 后。挑 取单个红色、圆形隆起、光滑湿润、边缘整齐的菌落进行细 菌形态革兰氏染色镜检。接种于伊红美蓝培养基和三糖铁琼脂 培养基等,是否有金属光泽和发酵等,转接于LB琼脂平板培 养基上划线纯化培养,37益培养18耀24h后供生化试验用。 1.2.2 生化试验 按常规方法对分离菌株进行10项生化试验,观察记录。 1.2.3 PCR反应体系和条件 作者简介:杨莉(1975.9-),女,副研究员,从事畜禽疫病和猪病研究工作。 项目来源:贵州省科学技术厅、农科院联合基金项目,项目名称:仔猪致病性大肠杆菌快速诊断与耐药性研究,项目合同编号:黔科合LH字 【2014】 7694号。 督机构。这样可以把检测机构与处罚机构分开,执法人员在 监督执法过程中,工作质量势必得到提髙。为确保处罚结果 的公平公正,选用的第三方监督机构与相关部门的检测机构 之间不存在隶属

参考文献

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