desmoplakin基因在斑马鱼早期胚胎表达的研究

作者:肖春;刘虓;胡火珍 刊名:四川动物 上传者:洪刚

【摘要】斑马鱼是现今研究脊椎动物发育的重要模式动物。目前桥粒斑蛋白(desmoplakin,DSP)的时空表达模式还没有详尽的描述,为了研究桥粒斑蛋白在发育过程中的时空表达,我们从斑马鱼胚胎提取了总RNA,制备cDNA,并以其为模板克隆得到desmoplakin基因。利用整体原位杂交技术研究了该基因在斑马鱼胚胎的时空表达图谱。结果显示,该基因在胚层分化前没有表达,在胚盾期后主要在表皮、耳和原肾管表达,并暗示DSP在这些器官发育过程中发挥重要作用。

全文阅读

斑马鱼是目前发育生物学研究中广泛使用的一种模式生物,属于脊椎动物。斑马鱼具有易繁殖,发育周期较短,胚胎在早期透明易观察等特点,为利用分子生物学手段研究斑马鱼的基因表达,揭示斑马鱼发育的分子机理奠定了很好的基础。对斑马鱼的发育研究为高等哺乳动物发育机理的探索提供了重要的线索。在高等动物的发育过程中,细胞间连接对调控细胞间粘附、信号通信、分化、迁移、增殖、细胞形态和极性都有着重要作用。细胞间连接分为4类:1.紧密连接,2.间隙连接,3.胞间连丝,4.桥粒连接。其中桥粒连接主要存在于上皮细胞和心肌细胞之间,是一种胞间非常牢固的连接。其核心超微结构为桥粒,由多种蛋白成分组成。桥粒斑蛋白(desmo-plakin,DSP)是构成桥粒的主要蛋白质,目前研究非常活跃。本研究收集受精后在28.5下发育24h的斑马鱼胚胎,利用注射器破碎胚胎,提取总RNA,反转录获得cDNA。根据GenBank所提供斑马鱼desmo-plakina的mRNA序列(GenBank:BC090682.1)设计特异引物,以所获得的24h胚胎的cDNA为模板通过PCR扩增出所需片段,将其连接于T-easy载体上作为原位杂交探针的模板。此段mRNA翻译出的蛋白质序列虽然不是斑马鱼desmoplakina的全序列,但与人类desmoplakin所对应部分的相似度高达62.78%。目前,除了通过临床病症发现桥粒斑蛋白的特异表达区域外,在胚胎发育过程中,桥粒斑蛋白的时空表达模式还没有详尽的描述。本研究以斑马鱼为模式动物,通过整体胚胎原位杂交方法探讨在斑马鱼胚胎发育的前72h的桥粒斑蛋白的时空表达模式,进而为在高等哺乳动物胚胎发育过程中出现的因桥粒斑蛋白异常所引起的临床现象提供思索的根据。1材料和方法利用整体原位杂交技术(wholemountinsituhy-bridization)检测基因在斑马鱼早期胚胎中的时空表达模式。将实验用斑马鱼雌雄分开过夜,次日同放在孵化器中配对追尾后收集所产鱼卵,放在28.5下发育,按不同时期收集受精鱼卵。所收集鱼卵用4%的多聚甲醛固定过夜,然后依次转入30%、50%、70%、90%、100%的甲醇中,-20保存,用于原位杂交。从斑马鱼卵中提取总RNA,反转录获得cDNA。以cDNA为模板,设计引物通过PCR扩增目的基因片段连于T-easy载体上。线性化载体用于合成目的基因特异的anti-RNA探针和sense-RNA探针(地高辛标记)进行原位杂交实验。胚胎整体原位杂交的方法参照ChristineThisse等的方法进行。取各个时期的胚胎,水化,使用蛋白酶K(10g/mL)在室温下处理,处理时间参照表1;固定后加入预杂交液(50%甲酰胺,5SSC,0.1%Tween20,RNase-free水,使用柠檬酸调pH值至6.0)65水浴预杂交4h;之后加入含有探针(探针浓度根据杂交结果调整)的杂交液(50%甲酰胺,5SSC,0.1%Tween20,50g/mL肝素,500g/mLRNase-freetRNA,RNase-free水,使用柠檬酸调pH值至6.0)65水浴杂交过夜;回收含有探针的杂交液,加入50%甲酰胺和2SSCT溶液,65,放置30min,重复一次;换入2SSCT溶液,65,放置15min;换入0.2SSCT溶液,65,放置30min,重复一次。用MABT洗两次,每次5min,放在摇床轻轻摇动;室温下加入阻断溶液(灭活羊血清10%BMblockingreagentMABT=127)封闭1h;加入抗地高辛的抗体(13000)4孵育过夜;洗去抗体,加入NBT/BCI

参考文献

引证文献

问答

我要提问