ptges3a基因在斑马鱼早期胚胎发育过程中的表达

作者:韩勇军;吴新荣 刊名:第三军医大学学报 上传者:李艳芳

【摘要】目的克隆斑马鱼前列腺素E合酶3a(prostaglandin E synthase 3a,ptges3a)基因,研究其在斑马鱼胚胎早期发育中的表达情况。方法提取斑马鱼胚胎的总RNA,制备DIG标记的ptges3a RNA反义探针,整胚原位杂交研究ptges3a在斑马鱼胚胎早期发育过程的表达。结果 ptges3a在shield期前普遍性表达,10体节期在后脑神经龙骨处有特异性表达,18体节期在后脑有特异性表达,在26 hpf时期头部表达较多,并且在肾小管有特异性表达,36 hpf ptges3a在头部较高表达。结论 ptges3a可能参与了脑部发育和肾小管形成。

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前列腺素(prostaglandin,PG)E2是一种重要的前列腺素类物质,参与机体多种生理及病理过程,前列腺素E合成酶(prostaglandinEsynthase3,ptges3)是PGH2转化为PGE2过程中的重要终端限速酶。多项研究[1-3]结果显示,ptges3在结肠癌、肺癌、头颈部肿瘤、乳腺癌和胃癌中过表达,且与肿瘤的发生、发展密切相关。缺失ptges3的小鼠可以消除炎症,类似于非甾体抗炎药(non-steroidalanti-inflammatorydrug,NSAID)作用的效果[4],动脉粥样硬化患者的巨噬细胞中ptges3有高表达,可诱导血小板破裂[5]。ptges3可能成为用于治疗疾病和筛选药物的潜在靶点。斑马鱼是近几十年出现的新型模式生物,它有许多优点:个体小、喂养费用便宜;早期胚胎透明,易于观察和操作;产卵多,繁殖周期短。通过序列比对和进化树分析发现斑马鱼ptges3a与小鼠、人的ptges3具有高度同源性。整胚原位杂交技术是研究斑马鱼发育相关基因的功能和表达模式的一种重要手段。本研究通过整胚原位杂交方法分析了ptges3amRNA在斑马鱼早期胚胎发育过程中的表达情况,为深入研究这一基因的功能提供基础依据。1材料与方法1.1材料斑马鱼Tubingen野生型,总RNA提取试剂盒RNAqueous-4PCRKit(Ambion公司),PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成,琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、大肠杆菌DH5感受态细胞、普通质粒小提取试剂盒(Tiangen公司),T4DNA连接酶、pGM-Teasy载体、DIGRNALabelingMix(Roche公司),SP6RNAPolymerase(Promega公司),限制性内切酶Apa、ExTaq聚合酶(TaKaRA公司),Anti-Digoxigenin-AP、染色剂:NBT和BCIP(Roche公司)。1.2方法1.2.1人、小鼠和斑马鱼的ptges3基因进化树分析从生物技术信息网页(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/)获取人、小鼠的ptges3基因和斑马鱼ptges3a基因序列,用CLCSequenceViewer6.1软件进行构建系统进化树。1.2.2提取总RNA收集24hpf时期的Tubingen野生型斑马鱼胚胎,按照RNAqueous-4PCRKit说明进行操作,-70保存。1.2.3RT-PCR扩增将提取的总RNA用随机引物法进行反转录。根据斑马鱼ptges3a基因mRNA序列,设计这2个基因的引物,ptges3a上游:5-TGATGGGTGAACACTGAAAGG-3,下游:5-TGGAGGGAGAAGGCAGAATA-3,PCR产物大小为898bp。内参为-actin上游:5-GCCGTGACCTGACTGACTACCT-3,下游:5-CGCAAGATTCCATACCCAAGA-3,PCR产物大小为273bp。用cDNA模板扩增,琼脂糖凝胶电泳鉴定,用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收扩增的目的基因。1.2.4克隆PCR产物将回收纯化的ptges3aDNA片段连接到Teasy载体上[6-7],42热激法转化到感受态DH5中,经氨苄抗性筛选重组质粒克隆。1.2.5菌落PCR鉴定和测序挑取单个菌落进行摇床培养3h,以菌液为模板进行PCR扩增,凝胶电泳检测是否有目的基因;将菌落PCR鉴定有目的基因的重组质粒送到华大基因公司进行测序。1.2.6制备反义mRNA探针将提取纯化的Ptges3a重组质粒用Nco酶切线性化,用异丙醇纯化,经

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