HIV-1 HXB2株Tat核心碱性区多肽Tat_(38-61)的原核表达及其免疫反应性

作者:庞强;曹洁;陈秋莉;王锦红;张华群;黄德胜;葛宜兵;潘卫 刊名:中国生物制品学杂志 上传者:林毅红

【摘要】目的 构建HIV-1 Tat核心碱性区多肽Tat38-61重组原核表达质粒,在大肠杆菌中表达融合蛋白并进行纯化及免疫反应性检测。方法采用PCR法从HIV-1 HXB2株Tat1-101基因中扩增编码Tat38-61的基因序列,克隆至原核表达载体pET32a(+)中,构建重组原核表达质粒pET32a(+)-Tat38-61。转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经Ni2+-NTA柱亲和层析法纯化后,ELISA法鉴定其免疫反应性。结果重组原核表达质粒pET32a(+)-Tat38-61经双酶切及测序表明构建正确;SDS-PAGE分析显示,在相对分子质量约21 300处可见目的 蛋白条带,表达量占菌体总蛋白的67.4%,主要以可溶形式表达;纯化后融合蛋白的纯度可达97%以上;ELISA结果显示,该融合蛋白与兔抗PEPTIDE-Tat1-101血清及HIV阳性血清均呈特异性反应。结论已成功构建了HIV-1 Tat核心碱性区多肽Tat38-61的重组原核表达质粒,表达并纯化了PET32a(+)-Tat38-61融合蛋白,该融合蛋白碱性区表位得到较好的保留,为Tat38-61噬菌体突变文库的构建及亲和筛选奠定了基础。

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中国生物制品学杂志 2011 年 1 月第 24 卷第 1 期 Chin J Biologicals January 2011,Vol. 24 No. 1 Ⅰ型人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus-1,HIV-1)的反式激活蛋白(Trans-activator of transcription,Tat)是 HIV 感染早期产生的一种重要调控蛋白,在 HIV-1 的复制、扩散和致病中起重要作用。HIV-1 感染靶细胞后,胞质中合成的 Tat 转移到核内,与多种转录调控因子结合组成转录起始复合 体,促进病毒 RNA 的转录、延伸和病毒复制[1]。此外,Tat 还可被感染细胞通过多种方式分泌到胞外,发挥“病毒毒素”的作用,抑制免疫反应[2-4],促进Kaposi 肉瘤的形成及艾滋病脑病的发生[5-6]。阻断Tat 对病毒复制的影响及其细胞外毒性作用是制备 Tat 疫苗的主要依据[7]。 研究表明,Tat 蛋白核心区(38-48 aa)可与旁观未感染细胞的微管蛋白结合引发细胞凋亡[8];Tat 蛋白碱性氨基酸富集区(49-57 aa)是 Tat 的穿膜和核定位功能基序,是 Tat 蛋白的主要中和表位之一[9],其中和抗体可消除 Tat 分子所特有的穿入细胞发挥 基金项目:国家自然科学基金资助项目(30872246,30972799);上海市基础研究重点项目(08JC1405200) . 作者单位: 1 第二军医大学微生物教研室(上海 200433); 2 安徽 医科大学病理生理学教研室(合肥 230032) . 通讯作者:潘卫,E-mail:pwpanwei@yahoo.com.cn 中国图书分类号 R373. 9 Q78 文献标识码 A 文章编号 1004-5503(2011)01-0010-05 【基础研究】 HIV-1 HXB2 株 Tat 核心碱性区多肽 Tat38-61 的原核表达及其免疫反应性 庞强 1 曹洁 1 陈秋莉 1 王锦红 1 张华群 1 黄德胜 2 葛宜兵 2 潘卫 1 【 摘要 】 目的 构建 HIV-1 Tat 核心碱性区多肽 Tat38-61 重组原核表达质粒,在大肠杆菌中表达融合蛋白并进行纯化及免疫反应性检测。方法 采用 PCR 法从 HIV-1 HXB2 株 Tat1-101 基因中扩增编码 Tat38-61 的基因序列,克隆至原核表达载体 pET32a(+)中,构建重组原核表达质粒 pET32a(+)-Tat38-61。转化大肠杆菌 BL21(DE3),IPTG 诱导表达。表达产物经 Ni2+-NTA 柱亲和层析法纯化后,ELISA 法鉴定其免疫反应性。结果 重组原核表达质粒 pET32a(+)-Tat38-61 经双酶切及测序表明构建正确;SDS-PAGE 分析显示,在相对分子质量约 21 300 处可见目的蛋白条带,表达量占菌体总蛋白的 67. 4%,主要以可溶形式表达;纯化后融合蛋白的纯度可达 97%以上;ELISA 结果显示,该融合蛋白与兔抗 PEPTIDE-Tat1-101 血清及 HIV 阳性血清均呈特异性反应。结论 已成功构建了 HIV-1 Tat 核心碱性区多肽 Tat38-61 的重组原核表达质粒,表达并纯化了 PET32a(+)-Tat38-61 融合蛋白,该融合蛋白碱性区表位得到较好的保留,为 Tat38-61 噬菌体突变文库的构建及亲和筛选奠定了基础。 【关键词】 tat 基因产物,人免疫缺陷病毒;核心碱性区;重组融合蛋白质类;原核细胞;基因表达;免疫反应性

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