汉族类风湿关节炎患者HLA-DM和-DR基因的表达

作者:王福玉 刊名:医学信息(上旬刊) 上传者:方晓平

【摘要】目的探讨我国汉族类风湿关节炎(RA)患者的人类白细胞抗原(HLA)-DM(DMA和DMB)基因的表达。方法以33名正常献血者及26例强直性脊柱炎(AS)患者为对照,应用半定量和竞争性逆转录-多聚酶链式反应(RT-PCR)检测36例RA患者,用抗CD19单克隆抗体包被的磁珠从外周血中分离出B细胞的HLA-DMA、-DMB及-DRB基因转录物的量。并应用Westernblot分析HLA-DM和-DR的蛋白表达量。结果与正常对照组或AS组相比,RA患者的HLA-DMA和-DMB转录物的表达均明显降低(P<0.01)。而与正常对照组相比,RA患者的DRB转录物的表达差异无显著性(P>0.05)。RA组的HLA-DM/DR平均比值明显低于正常对照组(P<0.01)。从蛋白质水平看,与正常对照组相比,RA患者的DMA/β-actin比值明显降低(P<0.01),而DRA/β-actin比值在两组间差异无显著性(P>0.05)。结论 RA患者的HLA-DM基因的转录水平和蛋白质水平均有明显下降,这在RA的发病过程中可能起了重要作用。

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类风湿关节炎(rheumatoidarthritis,RA)是一种慢性炎性关节疾病,其病因和发病机制仍不清楚。自从1991年Kelley等报告了一种主要参与组织相容性抗原类分子(MHC)的抗原递呈的HLA-DM基因(包括DMA和DMB)以来,国外学术界已对它与多种自身免疫性疾病包括类风湿关节炎(RA)的相关性进行了较多的研究,国内这方面的研究甚少。为此,我们从mRNA和蛋白质水平对36例汉族RA患者进行了DM基因表达的研究,现介绍如下。1资料与方法1.1一般资料以26例汉族强直性脊柱炎(AS)患者和33名健康献血者为对照组,以36例汉族RA患者(RA组)为研究对象。所有RA和AS患者均分别符合美国风湿病协会(ACR)1987年诊断标准[1]和1984年修订的纽约标准[2]。1.2实验方法1.2.1外周血B细胞的分离及总RNA的提取:用抗CD19单克隆抗体包被的磁珠从新鲜的外周血中分离出B细胞,并应用RNeasy试剂盒直接抽提总RNA,加入RNase抑制剂,-70保存备用。1.2.2半定量和竞争性逆转录-多聚酶链式反应(RT-PCR):应用以下条件把总RNA逆转录为cDNA:反应体积为25l,逆转录酶200U,37,孵育1h。立即使用cDNA进行PCR(参照文献[3]),每个RNA样本至少进行2次逆转录反应。用于DMA和DMB扩增的引物序列分别为5UFAM-CT-GTGTGGCAAGAAGGTATGGGT-3和5-ACAGA-CATTTGGAGGAAGAGGGA-3,及5UFAM-GGCA-TCTTTACAGAGCAGAGCAT-3和5-ATGTGAA-ATCCTTTGGAGTCCCA-3。用于三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)扩增的引物序列为5-GGATTTG-GTCGTATTGGG-3和5TAMRA-GTTCTCAGCCTT-GACGGT-3。扩增出的片段经5h电泳后进行分离。显示出的荧光峰应用Genescan软件进行扫描,并获得荧光密度。比较不同个体的HLA-DM/GAPDH比值。HLA-DRBmRNA表达的定量测定、引物的序列及竞争性PCR的条件详见文献[3]。1.2.3Westernblot分析测定HLA-DM和-DR的蛋白表达量:B细胞分离后,用细胞裂解缓冲液[10mmol/LTris盐酸(pH715),100mmol/L氯化钠,015%脱氧胆酸钠,1mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA),1%NP240,011%十二烷基硫酸钠(SDS),和蛋白酶抑制剂)裂解细胞。每种样品进行2种稀释度,加入到10%的SDS2聚丙酰胺凝胶上,把蛋白质再印记到Hlybond-P膜上,用抗DMA抗体和抗-actin抗体进行探测,然后加入用辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG,用增强化学发光试剂盒进行检测。剥脱下的膜再用抗DMA抗体和抗-actin抗体再次检测,然后加入用HRP标记的羊抗鼠IgG,用增强化学发光试剂盒进行检测,扫描胶片,用NIH图像软件进行定量,比较组间DMA/-actin的比值。1.3统计学分析两组间的比较采用t检验,显著性界值为0.05。2结果2.1HLA-DM和-DR转录物的测定:与正常对照组和AS组相比,RA患者的HLA-DMA和-DMB转录物的表达明显降低(P<0.01)。而与正常对照组相比,AS患者的HLA-DMA和-DMB转录物的表达差异无显著性(P>0.05),RA组的DRB/GAPDH比值差异无显著性(P>0.05),见表1。通过计算每个RA组和正常对照组成员的HLA-DM/DR比值发现,RA组患者的平均比值明显低于正常对

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