实验性大鼠肺纤维化模型与干扰素α-1b和氢化可的松的干预效应

作者:庄谊;张德平 刊名:中国临床康复 上传者:孙彬

【摘要】目的:探讨干扰素α-1b和氢化可的松对博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化模型的影响。方法:实验于2003-12/2004-02在南京医科大学动物实验中心及南京大学医学院附属南京鼓楼医院科研部完成。①选用SPF级雄性SD大鼠80只。将大鼠随机分为4组,每组20只:模型对照组,干扰素α-1b干预组,氢化可的松干预组,正常对照组。②模型对照组、干扰素α-1b干预组、氢化可的松干预组均于实验开始时气管内一次性注射博莱霉素5mg/kg,以造成肺纤维化模型。模型对照组于造模后次日起隔日皮下注射生理盐水0.2mL。干扰素α-1b干预组于造模后次日起隔日皮下注射干扰素α-1b10万IU。氢化可的松干预组于造模后次日起每日腹腔注射氢化可的松10mg/kg。正常对照组:实验开始时气管内一次性注射生理盐水2mL/kg,次日起隔日皮下注射生理盐水0.2mL。③各组大鼠均于实验第3,7,14和28天以腹主动脉放血法各处死5只。收集支气管肺泡灌洗液10mL,用于测干扰素γ和转化生长因子β含量,该含量测定双抗体夹心法测定,根据标准曲线计算含量。④取右肺中下叶投入液氮中,过夜后转入-70℃保存,准备检测羟脯氨酸含量,该含量测定采用南京建成生物工程研究所提供的羟脯氨酸检测试剂盒完成。⑤确定各组大鼠肺泡炎和肺纤维化程度[肺泡炎分4级:(-):无肺泡炎,评0分。(+):轻度肺泡炎,表现为单核细胞浸润使肺泡隔增宽,仅限于局部和近胸膜部,面积小于全肺的20%,肺泡结构正常,评1分。():中度肺泡炎,受累面积占全肺的20%~50%,近胸膜部较重,评2分。():重度肺泡炎,面积大于50%,偶见肺泡腔内有单核细胞及出血造成实变,评3分。肺纤维化分4级:(-):无纤维化,评0分。(+):轻度纤维化,受累面积小于20%,纤维化累及胸膜及胸膜下的肺间质,肺泡的结构发生紊乱,评1分。():中度纤维化,病变范围约占全肺的20%~50%,纤维化区域从胸膜延伸,仍属局部性,评2分。():重度纤维化,病变范围大于50%,融合损失可见大小不等的囊气腔,评3分]。⑥计量资料差异性测定采用方差分析,组间比较行LSD-t检验。结果:大鼠80只均进入结果分析。①肺纤维化大鼠肺泡炎和纤维化评分:模型对照组、干扰素α-1b干预组、氢化可的松干预组大鼠造模后7d肺泡炎最重,随后逐渐减轻,而纤维化于造模后第14天开始明显加重,第28天纤维化程度最重,各组的肺泡炎和纤维化程度始终较正常对照组严重(P<0.05~0.01),说明肺纤维化模型成立。干扰素α-1b干预组于造模后第7和14天时肺泡炎明显重于模型对照组(P<0.05,0.01)。而干扰素α-1b干预组纤维化程度虽重于模型对照组,但无明显差异(P>0.05)。氢化可的松干预组肺泡炎和纤维化程度虽轻于模型对照组,但始终与模型对照组相近(P>0.05)。②大鼠支气管肺泡灌洗液中干扰素γ含量:模型对照组、干扰素α-1b干预组于造模后开始升高,第7天达到高峰,随后逐渐下降。干扰素α-1b干预组造模后第3~28天始终明显高于模型对照组(P<0.01)。氢化可的松干预组相对比较稳定,第7天时显著低于模型对照组(P<0.05)。③大鼠支气管肺泡灌洗液中转化生长因子β水平:模型对照组、干扰素α-1b干预组、氢化可的松干预组于造模后开始升高,于造模后第7天达到高峰,随后下降,但始终高于正常对照组(P<0.01)。干扰素α-1b干预组于造模后第3和7及14天时显著高于模型对照组(P<0.01),第3天时氢化可的松干预组显著低于模型对照组(P<0.05)。结论:①早期应用干扰素α-1b能够加重博莱霉素诱导的肺纤维化,加重肺泡炎。②干扰素α加重肺纤维化的现象可能与其诱导干扰素γ的产生促进肺部炎症反应有关。③糖皮质激素可能是通过减少前炎症因子干扰素γ及纤维化相关的细胞因子转生长因子β的表达,抑制早期炎症,达到减轻肺纤维化的目的。

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0引言近年来有学者认为,CD4+辅助细胞(Th细胞)Th1/Th2细胞亚群。Th1/Th2失衡可能在肺纤维化的发病过程中起重要作用,当Th1型细胞因子如干扰素、白细胞介素12等表达相对减少,Th2型细胞因子如白细胞介素4、转化生长因子等表达相对占优势时,可导致纤维化的发生[1]。作为干扰素家族中的一员,干扰素具有促进T淋巴细胞反应向Th1优势转化的作用,并已成功应用于肝纤维化等的治疗。本实验利用博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化模型,观察干扰素-1b对其影响作用,并与氢化可的松的干预效果作比较。1材料和方法设计:完全随机分组设计,随机对照实验。单位:南京大学医学院附属南京鼓楼医院呼吸内科。材料:实验于2003-12/2004-02在南京医科大学动物实验中心及南京大学医学院附属南京鼓楼医院科研部完成。选用SPF级雄性SD大鼠80只,814周龄,体质量200250g,购于南京医科大学动物实验中心[许可证号:SCXK(苏)-2002-0031]。所有大鼠均在标准条件下饲养(标准温度、湿度、12h明暗周期、可自由摄食)。80只大鼠随机分为4组,每组20只:模型对照组,干扰素-1b干预组,氢化可的松干预组,正常对照组。设计、实施、评估者:设计、干预实施和评估均为第一、二作者,均接受过培训,未采用盲法评估。方法:主要药物和试剂:博莱霉素A5(天津太河制药有限公司,批号:030402);干扰素-1b(深圳科兴公司,批号:020706);氢化可的松注射液(天津金耀氨基酸有限公司,批号:0305172);大鼠干扰素酶联免疫吸附试剂盒(美国Biosource公司生产,上海森雄公司分装);大鼠转化生长因子酶联免疫吸附试剂盒(美国R&D公司生产,上海茂元公司分装);羟脯氨酸检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)。分组干预:模型对照组:实验开始时气管内一次性注射博莱霉素5mg/kg,次日起隔日皮下注射生理盐水0.2mL。干扰素-1b干预组:气管内注射博莱霉素后,次日起隔日皮下注射干扰素-1b10万IU。氢化可的松干预组:气管内注射博莱霉素后,次日起每日腹腔注射氢化可的松10mg/kg。正常对照组:实验开始时气管内一次性注射生理盐水2mL/kg,次日起隔日皮下注射生理盐水0.2mL。标本选取:各组大鼠均于造模后第3,7,14和28d以腹主动脉放血法各处死5只。处死后,打开胸腔,按史菲等[2]的方法,结扎右肺门,于左肺行肺泡灌洗术,收集支气管肺泡灌洗液10mL,-70保存,供测干扰素和转化生长因子含量用。取右肺上叶于中性甲醛固定,石蜡包埋,病理组织切片,行苏木精-伊红和Masson染色。右肺中下叶投入液氮中,过夜后转入-70保存,准备检测羟脯氨酸含量。肺组织病理分析:根据Szapriel等[3]方法确定肺泡炎和肺纤维化程度,其分级和评分标准如下:肺泡炎分4级:(-):无肺泡炎,评0分。(+):轻度肺泡炎,表现为单核细胞浸润使肺泡隔增宽,仅限于局部和近胸膜部,面积小于全肺的20%,肺泡结构正常,评1分。():中度肺泡炎,受累面积占全肺的20%50%,近胸膜部较重,评2分。():重度肺泡炎,面积大于50%,偶见肺泡腔内有单核细胞及出血造成实变,评3分。肺纤维化分4级:(-):无纤维化,评0分。(+):轻度纤维化,受累面积小于20%,纤维化累及胸膜及胸膜下的肺间质,肺泡的结构发生紊乱,评1分。():中度纤维化,病变范围约占全肺的20%50%,纤维化区域从胸膜延伸,仍属局部性,评2分。():重度纤维化,病变范围大于50%,融合损失可见大小不等的囊气腔,评3分。支气管肺泡灌洗液中干扰素、转化生长

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