牛磺酸对肾性高血压大鼠心肌细胞凋亡的干预作用

作者:高明灿;王福清;李志毅 刊名:中国临床康复 上传者:吴兴明

【摘要】目的:探讨含硫氨基酸牛磺酸对肾性高血压大鼠左室心肌细胞凋亡的影响。方法:实验于2004-06/10在商丘医学高等专科学校生理学教研室实验室完成。选择健康雄性五六周龄Wistar大鼠75只,分为3组:①模型组(n=30):制备肾血管性高血压大鼠模型,戊巴比妥钠麻醉后游离左肾动脉,并用内径为0.25mm银夹缩窄。术后大鼠均注射青霉素防感染。术后4周每周测血压1次,凡术后收缩压较术前升高20mmHg(1mmHg=0.133kP)以上,且高于135mmHg者确定为高血压形成。②假手术组(n=30):手术操作除左肾动脉不安置银夹外,余同模型组,于术后4周末及12周末各麻醉处死15只。③用药组(n=15):于术后4周末对确定造模成功的大鼠灌饲牛磺酸50mg/(Kg·d),给药8周后麻醉处死。相应模型组及假手术组大鼠灌以同等体积的生理盐水。凋亡原位检测采用缺口末端标记法。采用放免法检测心肌血管紧张素Ⅱ含量。采用分光光度计法检测心肌DNA含量。分别测定于不同时段处死大鼠的心肌血管紧张素Ⅱ含量(放免法)、心肌细胞凋亡指数(缺口末端标记法,以阳性染色细胞的平均光密度值表示)及心室肌总DNA含量(分光光度计法,以心肌DNA含量/心室肌质量表示)。结果:模型组在术后4周末及12周末分别有6和7只大鼠造模失败,用药组在术后4周末有7只大鼠造模失败。进入结果分析模型组、假手术组及用药组分别为17,30和8只。心肌血管紧张素Ⅱ含量、心肌细胞凋亡指数及心室肌总DNA含量:模型组大鼠术后4周、12周末犤(10.40±2.90)mg/g,(1.08±0.13),(3.38±0.43)mg/g;(15.40±3.40)mg/g,(1.49±1.90),(3.92±0.48)mg/g犦均显著高于相应假手术组〔(5.30±1.40)mg/g,(0.53±0.07),(2.37±0.35)mg/g;(6.00±1.50)mg/g,(0.59±0.08),(2.41±0.39)mg/g犦(t=2.62~3.69,P<0.01)。模型组大鼠术后12周末均显著高于其术后4周末的相应水平(t=2.22~2.91,P<0.05~0.01)。用药组明显低于模型组术后12周末的相应水平犤(7.50±2.10e)mg/g,(0.63±0.09),(2.49±0.37)mg/g犦(t=2.14~2.74,P<0.01)。结论:肾性高血压大鼠心肌细胞凋亡增多,且凋亡增加呈时间依赖性。牛磺酸抑制心肌细胞凋亡的同时明显降低了心肌血管紧张素Ⅱ含量,牛磺酸可能通过降低心肌血管紧张素Ⅱ水平而抑制肾性高血压大鼠的心肌细胞凋亡。

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0引言细胞凋亡与许多心血管疾病的产生有关,例如高血压。机体富含的一种含硫氨基酸牛磺酸可降血压,逆转高血压心肌肥厚,降低循环缩血管物质(血管紧张素、内皮素)。本实验主要观察牛磺酸对肾性高血压大鼠心肌细胞凋亡的影响,并探讨心肌细胞凋亡与循环缩血管物质的关系。1材料和方法设计:观察对比动物实验。单位:商丘医学高等专科学校生理学教研室。材料:实验于2004-06/10在商丘医学高等专科学校生理学教研室实验室完成。选择健康雄性五六周龄Wistar大鼠75只,体质量180220g,由河南省实验动物中心提供(合格证号:410220)。凋亡检测试剂盒为德国B.M公司产品;牛磺酸由武汉中健科技服高明灿,等.牛磺酸对肾性高血压大鼠心肌细胞凋亡的干预作用ISSN1671-5926CN21-1470/Rwww.zglckf.comkf23385083@sina.com务有限公司提供;血管紧张素检测试剂盒由北京北方免疫试剂研究所提供。设计、实施、评估者:实验设计由第一作者完成,实施、资料收集及评估由本文所有作者共同完成,均经过系统培训。方法:二肾一夹(2KIC)型肾血管性高血压模型制备:经30mL/L戊巴比妥钠(30mg/kg体质量,腹腔注射)麻醉,俯卧固定,沿左侧腰大肌外缘于背部作一长约23cm切口,游离左肾动脉,并用内径为0.25mm银夹缩窄。术后大鼠均注射青霉素防感染,5万单位/d。术后4周每周测血压1次,凡术后收缩压较术前升高20mmHg(1mmHg=0.133kP)以上,且高于135mmHg者确定为高血压形成,并进行药物实验。将75只大鼠分3组:模型组(n=30):制备肾血管性高血压模型,于术后4周末及12周末各麻醉处死15只。假手术组(n=30):手术操作除左肾动脉不安置银夹外,余同模型组,于术后4周末及12周末各麻醉处死15只。用药组(n=15):于术后4周末对确定造模成功的大鼠灌饲牛磺酸50mg/(kgd),以5mL/(kgd)的容量给药,给药8周后麻醉处死。相应模型组及假手术组大鼠灌以同等体积的生理盐水。分别测定于不同时段处死大鼠的心肌血管紧张素含量、心肌细胞凋亡指数及心室肌总DNA含量。心肌血管紧张素含量测定:取定量左室心肌,称重后加入0.5mol/L乙酸5mL,煮沸15min,冷却后冰上匀浆(4),离心(3000r/min,20min),取上清液置-30低温冰箱保存,采用放免法测定,药盒购自北京北方免疫试剂研究所,按说明书操作,所有测量配副管。心肌细胞凋亡检测:采用缺口末端标记法对凋亡细胞进行原位检测,主要流程是:石蜡切片脱蜡,梯度酒精逐步水化,20g/L蛋白酶K37消化15min,3g/L双氧水溶液灭活内源性过氧化物酶,磷酸缓冲液洗,加末端转移酶与荧光标记的核甘酸反应混合液(37,lh),磷酸缓冲液洗;加过氧化酶标记的抗荧光抗体(37,0.5h),磷酸缓冲液洗,3,3-二氨基联苯胺显色,苏木素核复染,脱水透明封片,检测。阴性对照的反应混合液中不加末端转移酶,阳性对照用已知阳性片,以胞核着棕黄色为阳性,用计算计图像分析系统分析,每组随机取四五张切片,每张切片随机取10个视野,至少计数1000个细胞,以细胞阳性染色的平均光密度值表示凋亡指数。左室心肌DNA含量的测定:取定量左室心肌称重,其总DNA提取测定采用苯酚氯仿法犤1犦,DNA浓度测定应用分光光度计法。心室肌总DNA含量用DNA含量(g)/心室肌质量(mg)表示。主要观察指标:各组大鼠左室心肌细胞凋亡指数、心肌血管紧张素含量和心室肌总DNA含量。统计学分析:由第一作者采用SPSS10.0软件进行统

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