磁性白蛋白纳米球作为基因载体的研究

作者:侯欣欣[1] ;王静[1] ;侯听[2] ;邢秀玲[1] ;张敬霞[1] 刊名:医学研究杂志 上传者:徐珍凤

【摘要】目的制备载基因的磁性白蛋白纳米球,评估磁性白蛋白纳米球作为基因载体的可行性及体外的磁靶向性。方法采用去溶剂化一交联法制备载基因磁性白蛋白纳米球,分别运用透射电镜(TEM)、动态光散射分析(DLS)对其形态、粒径进行表征。应用绿色荧光蛋白基因系统(pGFP),观察载基因磁性白蛋白纳米球体外释放基因速率的情况及转染细胞的情况。运用普鲁士蓝染色法观察磁性纳米球的体外磁靶向性。结果载基因磁性纳米球在TEM检测下为球形,大小均匀,并且在载基因磁性纳米球中明显地观察到在电子密度较低的白蛋白纳米球中包裹着电子密度较高的磁性纳米粒。DLS显示载基因免疫磁性纳米球的水合粒径约为209nm。体外动态释放基因速率,计算其累积释放率显示,该材料13h释放基因为95.25%,曲线平缓;转染实验结果显示载基因磁性纳米球能够有效转染SMMC-7721细胞,且转染效率高于载基因纳米球。普鲁士蓝染色实验结果显示磁靶向组细胞内的铁颗粒明显多于非靶向组。结论成功制备了载基因磁性自蛋白纳米球,具有缓释基因的作用,并且能高效转染人肝癌细胞SMMC-7721。磁性白蛋白纳米球基因载体具有体外靶向性,有望作为一种潜在的靶向基因载体应用到生物医学领域。

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将基因导入到人体细胞中进行基因治疗,就要求基因载体能够安全、有效地将DNA传输到预设的细胞中。裸露的DNA不适合在体内传输,因为血清中的核酸酶能够把它迅速地降解。因此,一种理想的基因载体是能够在血清中稳定存在,并且能保护DNA免受核酸酶的降解。白蛋白是血浆中含量最多的蛋白质,作为内源性物质,并且是一种不具有调理作用的蛋白,早期的研究发现,将其包覆于纳米粒或脂质体表面,可降低微粒对巨噬细胞的亲和力,从而延长循环时间,提高治疗效率[1]。白蛋白纳米粒最初被广泛应用于制备缓释以及控释药物方面的研究[2]。研究表明由于白蛋白内源性的特点,白蛋白纳米粒具有良好的生物相容性和缓释功能,易被生物降解,无免疫原性,从而推动了白蛋白纳米粒用作基因载体的研究[3]。为了实现将治疗基因靶向性地输送到特定的器官或组织,减少对其他组织的不良反应,提高基因的利用率,靶向基因载体的探索势在必行。磁性纳米颗粒具有纳米效应,几乎没有细胞毒性,生物相容性好的特点,具有磁响应性,在外加磁场的情况下可以实现磁靶向性[4,5]。因此近年来被广泛地应用到生物医学领域,比如应用于磁共振显像、磁热疗和肿瘤的诊断等研究[6~8]。磁性白蛋白纳米球是结合了磁性纳米粒和白蛋白纳米球两方面优势应运而生的纳米传输系统。本研究制备了磁性白蛋白纳米颗粒,对其性质进行了表征,并探究其作为基因载体的可行性及磁靶向性。材料与方法1.实验材料:SMMC-7721细胞株(人肝癌细胞)购自中科院上海细胞研究所。表达绿色荧光蛋白的质粒p GFP购自上海Gene Pharma公司,氯化铁(Fe Cl3.6H2O)、氯化亚铁(Fe Cl2.4H2O)、戊二醛等化学试剂均为分析纯,购自中国医药上海化学试剂采购供应站。牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)购自美国Sigma公司。DMEM和胎牛血清购自美国Gibico公司。2.Fe3O4磁性纳米粒的制备:Fe3O4磁性纳米粒的制备参照文献[9],采用化学共沉淀法制备:(1)分别称量Fe Cl3·6H2O与Fe Cl2·4H2O各10.8g和4.37g,放入广口瓶内,溶解于200ml三蒸水内;(2)100ml的1mol/l的氨水迅速倒入广口瓶;(3)将液体置于加通气口塞的广口瓶放在磁力搅拌器上,放入搅拌子,充入N2保护,设定反应温度为50℃,设定搅拌速度为3000r/min,搅拌30min后停止。自然冷却,液体倒入烧杯,然后用强磁铁吸住烧杯底部,倾去上层废液,用去离子水反复冲洗生成物,洗涤3次,将生成物真空干燥备用。3.白蛋白纳米球(ANS)及载基因磁性白蛋白纳米球的制备:白蛋白纳米球的制备工艺参照文献[10,11],经过实验条件的摸索,确定了白蛋白纳米球的制备工艺如下:精密称取适量BSA100mg,Fe3O4磁性纳米粒40mg,加4ml三蒸水充分搅拌混匀成磁性材料、白蛋白混合液,调节p H值至9;乙醇以1ml/min的速度滴至上述已经孵化好的材料与白蛋白混合溶液中,继续搅拌,该过程为去溶剂化过程,纳米粒形成;向纳米粒溶液中缓慢滴加50μl 25%戊二醛溶液,室温磁力搅拌12~24h,使纳米粒交联固化,制得固化的白蛋白纳米球(albumin nanospheres,ANS)溶液。将纳米球溶液以12000r/min的转速高速离心,倾去上清液,加水至原体积,超声分散。洗涤3次,以去除制备中加入的有机溶剂。将Fe3O4磁性纳米粒悬液与质粒p GFP按30∶1的质量比混匀,再与100mg BSA混合搅拌均匀。待完全溶解后按上述制备方法制备载基因磁性白蛋白纳米球(p

参考文献

引证文献

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