乙醇对胃癌细胞缺氧与抗凋亡蛋白的影响

作者:张捷;邹晓平 刊名:海南医学 上传者:杨德光

【摘要】目的探讨乙醇对胃癌细胞缺氧诱导因子与抗凋亡蛋白Survivin的影响。方法将人胃癌细胞BGC823分组培养,加入5%-30%终浓度的乙醇培养1-4h,并设空白对照组,提取蛋白后采用免疫印迹法检测HIF-1α蛋白及Survivin蛋白的表达。结果在BGC823细胞中HIF-1α蛋白的表达随着乙醇浓度和时间的加大而增加;Survivin蛋白表达在乙醇处理1h后随着乙醇浓度的增加表现为先增加后减少,在乙醇处理4h后随着乙醇浓度的增加反而减少。结论在胃癌细胞BGC823中乙醇通过HIF-1α途径引起细胞缺氧,通过抑制抗凋亡蛋白Survivin促进细胞凋亡。

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短期高浓度乙醇摄入可以引起急性胃黏膜损伤,长期过量的乙醇摄入与多种肿瘤的发病率增高有关,如肝癌、口腔癌、食管癌、结直肠癌和乳腺癌[1]。乙醇对胃癌细胞的作用几乎无人研究,本研究目的是探讨不同浓度的乙醇对胃癌细胞的影响。1材料和方法1.1材料人胃癌细胞BGC823购自中科院上海细胞所;细胞培养液为含10%胎牛血清的DMEM培养液,胎牛血清及DMEM均为Gibco公司产品;无水乙醇;鼠抗人HIF-1单抗为Chemicon公司产品(MAB5382),兔抗人Survivin多抗为SantaCruz公司产品,鼠抗人Tubulin-单抗为Sigma公司产品,HRP标记的羊抗鼠二抗为Rockland公司产品,羊抗兔二抗为晶美公司产品;PVDF膜购自Roche公司,BCA蛋白定量试剂盒、化学发光试剂盒均购自Pierce公司。其余试剂均为分析纯。1.2方法1.2.1细胞培养胃癌细胞BGC823培养于含10%胎牛血清、100kU/L青霉素和100mg/L链霉素的DMEM培养液中,置于含5%CO2的37培养箱中,1-2d换液1次,长至培养瓶底面90%时采用0.25%胰酶消化传代。乙醇处理:细胞长至对数生长期时在培养液中分别加入终浓度为5%、10%、30%的无水乙醇模拟急性酒精损伤,培养时间分别为1h、4h,并设置空白对照组。1.2.2WesternBlot检测HIF-1蛋白及Sur-vivin蛋白的表达收集各组细胞,冰PBS洗2次,加入细胞裂解液[20mmol/LTris(pH7.5),4mmol/LEDTA(pH8.0),2%SDS]150L裂解细胞,超声破碎后12000r/min离心10min,取上清,用BCA蛋白定量试剂盒检测总蛋白浓度,取总蛋白60g上样,行稳流SDS-PAGE电泳,稳压冰浴电转至PVDF膜,5%脱脂奶粉室温封闭1h后TBST洗膜,加入一抗(工作浓度:鼠抗人HIF-11400;兔抗人Sur-vivin1200),4孵育过夜。次日TBST漂洗3次,每次5min,然后再加HRP标记的二抗(工作浓度为羊抗鼠110000;羊抗兔16000)室温孵育1h,TBST漂洗35min。ECL化学发光法显影,暗室曝光。-Tubulin(工作浓度为14000)为内参照。1.3统计学处理所得数据以meanSD表示,采用SPSS11.0软件进行统计分析,采用配对t检验,P<0.05为差异有统计学意义。TanonGis软件对感光胶片条带进行灰度值分析,以目的条带与内参照条带的比值代表目的蛋白的表达水平。2结果HIF-1与Survivin的Western检测结果见图12.1HIF-1的表达图1和表1说明在BGC823细胞中HIF-1蛋白表达随着乙醇浓度的加大而明显增加,并且HIF-1在乙醇处理后4h比1h后2稍.2增高Su。rvivin的表达图1和表2说明在BGC823细胞中Survivin蛋白表达在乙醇处理1h时随着乙醇浓度的增加表现为先增加后减少,在乙醇处理4h后随着乙醇浓度的增加反而减少。3讨论国内一般利用乙醇给大鼠灌胃,观察乙醇对大鼠胃黏膜的急性损伤作用。国外有学者利用低浓度乙醇培养肝癌细胞HEPG2,发现乙醇能够通过caspase-3途径诱导肝癌细胞凋亡[2]。进一步研究表明乙醇可能通过影响多种基因而诱导凋亡,但机制仍不明确[3]。细胞凋亡在相差显微镜下表现为细胞体积变小、形态变圆、折光度增强及细胞出芽(Membranebudding)等,梁惠云等[4]曾在实验中依赖相差显微镜和Giemsa染色(显示细胞核变化)来判断细胞凋亡,证明乙醇在1.5%-4%的浓度范围

参考文献

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