团头鲂致病性维氏气单胞菌的分离鉴定及药敏试验

作者:蔺凌云;潘晓艺;袁雪梅;姚嘉赟;徐洋;尹文林;许婷;郝贵杰;沈锦玉 刊名:水产养殖 上传者:金石声

【摘要】本文分离鉴定引发团头鲂暴发性死亡的病原菌,并寻找病原菌的敏感性药物。从患病团头鲂体内分离菌株,通过人工感染试验,常规形态学观察、主要生理生化特征及16s r DNA序列分析。结果表明,分离菌株鉴定为维氏气单胞菌,对头孢曲松、四环素、强力霉素、磷霉素等具有较强的敏感性,而对青霉素G、壮观霉素、复方新诺明、氟哌酸、链霉素、万古霉素等表现出耐药性。该实验为气单胞菌的鉴定及团头鲂细菌性疾病防治提供科学依据。

全文阅读

团头鲂(Megalobramaamblycephala),俗称鳊鱼,是我国重要的人工养殖淡水鱼类,在江苏、浙江、安徽等多地区均有养殖。2012年团头鲂的养殖产量为705,821t,居我国淡水养殖鱼类的第7位。大规模集约化的养殖模式下,鱼体本身受到较大的应激,免疫力下降,当环境中的病原微生物大量滋生时,极易发生病害流行,造成严重的损失。目前,团头鲂的主要病害仍然为细菌性病害,多为嗜水气单胞菌和温和气单胞菌感染引起[1-3]。维隆气单胞菌属于弧菌科气单胞菌属的一个成员,具有较强的毒力[4-5],能引起腹泻、肺炎以及伤口感染[6]和自身限制的肠胃炎[7]。关于维氏气单胞菌引发团头鲂暴发性死亡的情况报道较少[8]。本研究对濒临死亡的团头鲂的肝脏、脾脏和肾脏组织进行了病原菌的分离、鉴定及药敏试验,为该病害的防治提供技术指导。1材料与方法1.1实验材料及主要试剂胰酪胨大豆胨肉汤培养基(TSA)、生化微量鉴定管、药敏试纸购自杭州天和微生物试剂有限公司,Taq酶、dNTP、割胶回收试剂盒、pMD18-Tvector等购自TaKaRa公司。细菌16SrRNA基因通用引物,上游引物序列为5'AGAGTTTGATCCTG-GCTCAG3',下游引物序列为5'GGCTACCTTGT-TACGACTTC3',由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。健康团头鲂由本研究所养殖基地提供。1.2病鱼的来源及症状观察2014年10月下旬,江苏省武进区某水产养殖场的团头鲂成鱼出现大批死亡,取发病鱼塘里濒死的团头鲂观察,记录其症状,并剖检典型病鱼,记录其病理变化。1.3病原菌分离纯化选择具有典型症状的濒死团头鲂,无菌条件下,解剖病鱼,以肝脾肾为样本划线接种于TSA培养基,进行细菌分离培养。细菌培养温度为22(同发病水温),培养24~48h,挑选单个优势菌落,并多次划线作纯培养。1.4病原菌人工感染试验将纯化后的菌株在TSA平板上培养48h,无菌生理盐水洗下菌落,调整菌浓度为1107CFU/mL。腹腔注射感染健康团头鲂(0.1mL/尾),每组10尾,对照组注射等量生理盐水,每组设2个平行。感染后实验鱼置于水体25L水箱养殖,水温(221),每天投饵及换水吸污一次,养殖观察14d,记录试验鱼的发病症状和死亡情况,并对死亡鱼体进行解剖和致病菌的再分离,验证试验鱼的死亡是否由人工感染菌株引起的。1.5病原菌形态分析和生理生化鉴定将纯培养菌株于TSA培养基上22培养30h,挑取单菌落按照常规方法进行革兰染色,观察病原菌的形态、大小。细菌生理生化特性鉴定按照微量生化管操作说明进行。1.6病原菌16SrRNA基因的克隆及序列分析取培养好的菌液2mL,按照细菌基因组DNA试剂盒方法提取分离菌株的基因组DNA。以细菌16SrRNA通用引物:正向引物27F:(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'),反向引物1492r:(5'GGTTACCTTGTTACGACTT-3')扩增目的基因。PCR反应体系为50L:10PCR缓冲液(Mg2+)5l、DNA模板1l,10mol/mL引物各1L,10mol/mLdNTP1L,5U/LTaqDNA聚合酶0.5L,超纯水40.5L,混匀。反应条件:94预变性5min,9440s,5640s,7290s,35个循环,最后72延伸10min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶检测,割胶回收目的条带,连接pMD18T-vector,转化大肠杆菌感受态细胞,筛选阳性克隆进行测序。1.7药敏实验药敏实验采用K-B纸片法进行。调整菌液密度调至1107~l108cfu/mL,无菌条件

参考文献

引证文献

问答

我要提问