斑马鱼Mut-001基因的克隆及胚胎早期发育过程中的表达

作者:吕峰;王学谦;李丽萍;王新;刘东 刊名:黑龙江畜牧兽医 上传者:夏丽芳

【摘要】为了研究斑马鱼Mut-001基因的克隆及其在个体早期发育过程中的时空表达图谱,试验提取斑马鱼胚胎的总RNA制备地高辛标记的Mut-001 RNA反义探针,采用整体胚胎原位杂交(WISH)的方法研究Mut-001基因在斑马鱼早期发育过程中的表达。结果表明:试验成功克隆斑马鱼Mut-001基因并合成Mut-001基因探针,获得Mut-001基因在斑马鱼早期发育过程中的表达情况,Mut-001基因在1 000细胞期(受精后3小时,即3 hpf)、50%外包期(受精后5.3小时,即5.3 hpf)前普遍性表达;受精后14小时(14 hpf)开始在头部、肌节边界及躯干肌肉有特异性表达;受精后24小时(24 hpf)时这些部位表达更明显并在听囊、脊索出现特异性表达;受精后36小时(36 hpf)开始除了在头部和躯干肌肉持续特异性表达外,在胸鳍原基和心脏也开始特异性表达;受精后48小时(48 hpf)时上述部位持续特异性高表达。说明Mut-001基因在早期参与了中枢神经系统与肌肉的发生,在脑部、脊索、肌肉的发育中可能起到了重要作用。

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与果蝇、小鼠、鸡等传统模式生物相比较,斑马鱼的研究优势在于[1]:1)作为脊椎动物,斑马鱼遗传发育机制与哺乳动物有许多相似之处。2)斑马鱼个体小,成鱼体长仅3~4cm,便于大规模饲养。斑马鱼性成熟周期短,仅为3个月,成年雌鱼产卵量大,每条雌鱼每周可产卵200~1000枚。3)胚胎体外受精、体外发育、胚胎发育迅速,受精后5小时进入原肠胚期,24小时后主要器官如脑、眼、循环系统形成,胚胎透明可视,易于观察和操作。4)可以方便地进行大规模诱变产生大量突变个体,从而进行基因组突变筛选和表型分析。Mut基因由F.D.Ledley等[2]于1988年克隆后约有200种突变类型被报道,大多数为发生在外显子区域的碱基替换[3-4]。而目前对于人类甲基丙二酸血症(MMA)的研究认为:甲基丙二酰辅酶A变位酶(MCM)缺陷是由单一基因Mut引起[5-6];但我国对MMA的研究主要集中在临床研究,突变基因鉴定和基因诊断研究较少[7-8]。在斑马鱼中,关于Mut基因表达研究仍然未见报道,因此对斑马鱼Mut-001基因的克隆及其在个体早期发育过程中的表达情况研究将进一步揭示Mut基因在转录、翻译和重组过程中的作用。试验克隆了斑马鱼Mut-001基因并成功合成反义RNA探针,并对斑马鱼早期胚胎进行整体胚胎原位杂交(WISH),旨在揭示Mut-001基因在斑马鱼个体早期发育过程中的时空表达图谱,为后续研究奠定基础。1材料与方法1.1试验动物野生型斑马鱼胚胎,由南通大学神经再生重点实验室斑马鱼养殖基地提供;斑马鱼养殖系统,从北京爱生科技集团公司引进。受精卵在清晨由雌雄鱼交配所得,然后用孵化液(60mg/mL海盐)于28条件下孵化受精卵,每天更换孵化液;96小时时开始投放人工饲料,24小时时开始用0.003%苯硫脲(PTU)处理受精胚胎以防止黑色素形成。1.2主要试剂及仪器总RNA提取试剂盒、探针纯化回收试剂盒,Am-bion公司生产;PCR引物、pGEM-T载体,全式金公司生产;琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒,OMEGA公司生产;大肠杆菌DH5感受态细胞,天根生化科技(北京)有限公司生产;普通质粒小提试剂盒,博大泰克公司生产;T4DNA连接酶、T7RNA聚合酶,Fer-mentas公司生产;限制性内切酶,TaKaRa公司生产;DIGRNALabelingMix、Anti-digoxigenAP、染色剂(NBT和BCIP),Roche公司生产。1.3RT-PCR将提取的斑马鱼胚胎及成鱼各器官总RNA用随机引物法反转录成cDNA,根据斑马鱼Mut-001基因的mRNA序列圈定CDS区及设计Mut-001探针引物,引物序列:上游引物5'-GAGCCGTCATTC-CCATTCTA-3',下游引物5'-GCTCAGTAAGGGAC-CATCCA-3'。PCR产物大小为536bp,以cDNA为模板进行PCR扩增,将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定是否有目的片段,然后用DNA回收试剂盒回收扩增的目的片段。1.4载体的构建将回收、纯化的PCR产物和pGEM-T载体用T4DNA连接酶进行TA连接,采用42热激法将其转化至大肠杆菌DH5感受态细胞中,经氨苄抗性蓝白斑筛选重组质粒克隆。1.5菌落PCR、酶切鉴定及测序挑取白斑单克隆37摇床以250r/min的速度摇12~16h进行小摇,然后以小摇后菌液为模板进行PCR扩增,将扩增后的产物进行凝胶电泳检测,以明确是否含有目的片段;也可以将小摇后菌液进行小提,然后将提取的质粒进行酶切,接着跑凝胶电泳检测是否有目的片段。最后将经过鉴定存在目的基因的重组质粒的菌

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