转化生长因子β1对缺氧诱导的神经干细胞损伤的保护作用

作者:钱冰;赵小芳;吕春娥;于娜;韩冰;高殿帅;刘志安 刊名:神经解剖学杂志 上传者:杨炜杰

【摘要】目的:观察转化生长因子β1(transforming growth factor beta 1,TGF-β1)对缺氧诱导的神经干细胞(neural stem cells,NSCs)损伤是否具有保护作用。方法:取新生1 d的大鼠大脑皮质,进行NSCs的分离、培养、传代、诱导分化和鉴定。以三气培养箱(94%N2、5%CO2、1%O2)制备NSCs的缺氧损伤模型。取传代细胞,随机分为4组:正常对照组、三气缺氧组、溶剂对照组、生长因子组。各组细胞在相应时间点用Hoechst33258进行荧光染色,镜下观察、拍照,计算Hoechst染色阳性细胞率,评估三气培养对NSCs的损伤情况以及TGF-β1对这种损伤的保护作用。结果:在未诱导分化前,传代培养的细胞呈Nestin免疫反应阳性;用胎牛血清(fetal bovie serum,FBS)诱导分化后则分别呈Ⅲ型β-微管蛋白(typeⅢbeta tubulin,Ⅲβ-tubulin)和胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acid protein,GFAP)免疫反应阳性,表明分离到的细胞是神经干细胞。Hoechst33258染色显示,凋亡细胞呈强亮蓝色荧光;正常细胞弥漫均匀着色,无强荧光。与正常对照组相比,三气缺氧组的凋亡阳性细胞显著增多(P<0.05)。与三气缺氧组或溶剂对照组相比,生长因子组的Hoechst33258染色凋亡阳性细胞数显著减少(P<0.05),但仍明显多于正常对照组(P<0.05)。结论:TGF-β1能够显著减少三气培养法所诱导的NSCs的凋亡,提示TGF-β1对NSCs的缺氧损伤具有重要的保护作用。为深入研究TGF-β1在NSCs的相关临床应用中的潜在价值提供理论基础和实验依据。

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神经干细胞(neuralstemcells,NSCs)指的是在中枢神经系统中具有自我更新和多向分化潜能的一类细胞。通过对哺乳动物胚胎期NSCs的研究,人们已先后从大脑皮层、海马、纹状体、嗅球、脑室、间脑、中脑、小脑、脊髓和视网膜中分离得到了神经干细胞[1]。NSCs不仅存在于胚胎期,在成年哺乳动物中枢神经系统的嗅球、室管膜、室管膜下区以及海马齿状回也普遍存在[2,3]。NSCs在脑内可以增殖、迁移和分化,正是这种特性使其成为移植治疗的理想材料;神经干细胞的出现为治疗中枢神经系统相关疾病提供了全新的思路[4]。然而,NSCs在移植或替代治疗脑缺血等中枢神经系统相关疾病的过程中,可能会处于缺血缺氧、兴奋毒损伤等不利环境中,从而影响其存活和疗效。有文献报道,缺氧环境可以引起NSCs的凋亡[5]。因此,积极探索如何提高NSCs抗宿主脑内缺血缺氧、兴奋毒性等不利环境的能力就显得非常必要。要研究这一问题,首先必须建立一个离体的NSCs损伤模型。本实验拟采用经典的三气培养箱(94%N2,5%CO2,1%O2)制备神经干细胞的缺氧损伤模型[6]。那么,用什么办法来改善NSCs在缺氧环境下的生存状况呢?通过大量的文献查阅,我们想到了转化生长因子1(transforminggrowthfactorbeta1,TGF-1)。TGF-属于转化生长因子-超家族成员,是一种多功能蛋白质,可以影响细胞的生长和死亡、细胞外基质的形成、血管发生和免疫调节等功能[7]。TGF-所表现出来的功能主要取决于细胞的类型和状态。TGF-包括3个亚型即TGF-1、TGF-2和TGF-3。从胚胎早期起,三者在中枢神经系统都有表达。但在成年脑中,除了脑脊膜和脉络丛外,TGF-1在未损伤的神经系统内几乎不表达或表达水平很低;而TGF-2和TGF-3则广泛表达。TGF-1通过与其受体结合而发挥作用,所有的TGF-受体在皮质、海马、脑干和脊髓均有表达[8]。在神经系统中,TGF-1主要发挥神经保护作用。在脑缺血缺氧疾病中,TGF-1可以明显缩小梗死区域,具有促进神经元的存活、促进血管生成、损伤修复、抗氧化以及抗凋亡等作用。脑组织缺血缺氧后,内源性的TGF-1表达增多,使用TGF-1抑制剂,梗死灶增大,细胞凋亡增多。无论是内源性的TGF-1还是外源性TGF-1均起到了保护神经元的作用。在急性脑梗死脑组织研究发现,损伤区和近损伤区各类细胞均表达TGF-1[9]。在皮质神经元和星型胶质细胞共同培养中,TGF-1能够通过增加星形胶质细胞PAI-1的转录而对抗NMDA受体介导的细胞兴奋毒性作用[10]。TGF-1可以减轻兴奋毒性或缺氧对神经元的损伤,但是TGF-1对处于缺氧环境中的NSCs有无保护作用目前尚未文献报道。有鉴于此,本研究应用三气培养箱(94%N2、5%CO2、1%O2)制备神经干细胞的缺氧损伤模型,通过Hoechst33258荧光染色等方法观察TGF-1对NSCs的缺氧损伤是否具有保护作用。为深入研究TGF-1在NSCs的相关临床应用中的潜在价值提供理论基础和实验依据。材料和方法1材料1.1实验动物新生1d的SD大鼠,由徐州医学院实验动物中心提供。1.2主要试剂及仪器DMEM/F12无血清培养基以及FBS培养基购自Gibco公司。h-EGF、h-bFGF、TGF-1、SP试剂盒、Hoechst33258均购自Sigma公司。平衡湿度培养箱、三气培养箱购自日本SANYO公司。2方法2.1NSCs的体外分离培养、分化、鉴定取新生1d大鼠的适量端脑皮质,置于盛有DMEM/F12无血清培养基中、剪碎,40

参考文献

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