大鼠CB1基因真核表达载体的构建及其对CaSki细胞凋亡的影响

作者:严磊;李晶;赵婷婷;王会娟;王蕾;赖国旗 刊名:中国实验动物学报 上传者:简辉华

【摘要】目的构建大鼠CB1(r CB1)基因真核表达载体,检测r CB1基因在细胞中的表达,研究r CB1对人宫颈癌Ca Ski细胞凋亡的影响。方法从大鼠脑组织中提取总RNA,RT-PCR扩增r CB1基因,通过酶切、纯化、连接PCR纯化产物与p CDNA 3.1(+)质粒,构建pc DNA3.1(+)-r CB1。脂质体法将其转染到HEK293和Ca Ski细胞,Western blot及细胞免疫荧光联合激光扫描共聚焦方法检测r CB1的表达及定位,流式细胞仪检测细胞凋亡率,Western blot与实时荧光定量PCR检测r CB1、Bcl-2、Bax、Bad表达。结果酶切重组质粒获得5300 bp的载体片段和1500 bp的目的片段,测序结果和r CB1基因序列(NM_012784.4)一致。转染HEK293细胞后,r CB1在HEK293细胞细胞膜和细胞质表达。转染Ca Ski细胞后,r CB1使细胞凋亡率增加(P<0.05);r CB1基因上调Bax、Bad的表达,同时抑制Bcl-2的表达,与空白组比较,其差异具有显著性(P<0.05)。结论成功构建了pc DNA3.1(+)-r CB1真核表达载体,r CB1表达于细胞膜和细胞质,r CB1可以明显促进宫颈癌Ca Ski细胞凋亡,其机制是上调Bax、Bad和抑制Bcl-2表达。

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2015年 4月 第 23卷 第 2期 中国实验动物学报 ACTA LABORATORIUM ANIMALIS SCIENTIA SINICA April 2015 Vol 23 No.2 e 研 究报 告 ; 大鼠 CB 1基 因真核表达载体的构建及其对 CaSki细胞凋亡 的影 响 严磊 ,李 晶 ,赵婷 婷 ,王会娟 ,王 蕾 ,赖 国旗 (1.重 庆医科 大学实验动物 中心 ,重庆 400016;2.重庆三峡 医药高等专科学校 ,重庆 404120; 3.重庆 市啮齿类实验动物工程技术研究 中心 ,重庆 400016) 【摘要 】 目的 构建大 鼠 CB1(rCB1)基 因真核表达 载体 ,检测 rCB1基 因在 细胞 中的表达 ,研究 rCB1对 人宫 颈 癌 CaSki细胞凋亡 的影 响。方法 从大 鼠脑组织 中提取 总 RNA,RT—PCR扩增 rCB1基因 ,通过酶切 、纯化 、连接 PCR纯 化产物与 pCDNA 3.1(+)质粒 ,构 建 pcDNA3.1(+)-rCB1。脂 质体 法将其转 染到 HEK293和 CaSki细胞 , Western blot及 细胞 免疫荧光联 合激 光 扫描 共 聚焦 方 法检 测 rCB1的表 达 及定 位 ,流式 细胞 仪 检测 细胞 凋 亡率 , Western blot与实 时荧光 定量 PCR检测 rCB1、Bcl一2、Bax、Bad表达。结果 酶切重 组质粒获 得 5300 bp的载体 片段 和 1500 bp的 目的 片段 ,测序结果和 rCB1基 因序 列 (NM_o12784.4)一致 。转 染 HEK293细 胞后 ,rCB1在 HEK293 细胞细胞膜和细胞质 表达。转 染 CaSki细胞 后 ,rCB1使细 胞凋亡率增加 (P<0.05);rCB1基 因上 调 Bax、Bad的表 达 ,同时抑 制 Bcl一2的表 达 ,与空 白组 比较 ,其差 异 具有 显著 性 (P<0.05)。结论 成功 构建 了 pcDNA3.1(+)一 rCBI真核表达载体 ,rCB 表达于细胞膜和细胞 质 ,rCB1可以明显促进宫颈癌 CaSki细胞凋亡 ,其机制 是上调 Bax、 Bad和抑制 Bcl一2表达 。 【关键词】 CB1基因;HEK293细胞 ;CaSki细胞;细胞凋亡 【中图分类号】Q95—33 【文献标识码】A 【文章编号】10054847(2015)02-o153—06 Doi:10.3969/j.issn.1005—4847.2015.02.010 Construction of expression vector containing rat rCB 1 gene and its influence on the apoptosis in human cervical cancer CaSki cell line YAN Lei ,LI Jing ,ZHAO Ting—ting ,WANG Hui-juan ,WANG lei ,LAI Guo—qi (1.Laboratory of Animal Center of Chongqing Medical University,Chongqing 400016; 2.Chongqing Three Gorges Medical College,Chongqing 404120; 3.Chongqing Engineering Research Center OH Rodent Laboratory Animals,Ch

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