坎地沙坦改善C2C12细胞胰岛素敏感性的机制研究

作者:李凡;黄慧;宋立功;郝华;刘倩;牛轶瑄;英明中;曾强 刊名:中华保健医学杂志 上传者:贾闪闪

【摘要】目的研究血管紧张素II和坎地沙坦对小鼠骨骼肌细胞(C2C12)胰岛素敏感性的影响及其机制。方法C2C12诱导分化成熟后,分为对照组(C组)、模型组(M组:Ang II)、坎地沙坦低剂量组(Can1组:坎地沙坦0.1μM+Ang II)、坎地沙坦中剂量组(Can2组:坎地沙坦1μM+Ang II)、坎地沙坦高剂量组(Can3组:坎地沙坦10μM+Ang II)。各组细胞给予相应药物及胰岛素处理后,检测2-脱氧葡萄糖(2-NBDG)的摄取率,并用RT-PCR法和Western印记法分别检测各组细胞中磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(Akt)和胰岛素受体底物分子-1(ISR-1)的m RNA及蛋白表达水平。结果 M组摄取2-NBDG较C组明显降低(P<0.01),而Can3组摄取2-NBDG则较M明显增加(P<0.05)。M组ISR-1和Akt的m RNA表达较C组明显降低(P<0.01),Can2组及Can3组ISR-1、PI3K和Atk的m RNA表达较M组明显升高(P<0.05)。M组p-ISR-1和p-Akt蛋白表达较C组明显降低(P<0.01),Can2组及Can3组p-ISR-1和p-Akt较M组明显升高(P<0.05)。结论 Ang II通过下调胰岛素信号通路中重要因子ISR-1、Akt的m RNA及蛋白表达抑制胰岛素的生物学效应,引起骨骼肌细胞胰岛素抵抗;而坎地沙坦通过抑制Ang II的这种作用改善骨骼肌胰岛素抵抗。

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多项临床试验结果证实,血管紧张素II受体拮抗剂(angiotensinIIreceptorblocker,ARB)类降压药可降低高血压患者的2型糖尿病患病率[1-2]。由于ARB类药物的作用位点是血管紧张素II(angiotensinII,AngII)的受体1(angiotensinIItype1receptor,AT1R),因此有观点认为,ARB类药物通过抑制AngII与AT1R的结合可以改善胰岛素抵抗,但也有不同观点[3]。以往的研究结果显示,ARB类药物中的坎地沙坦可以改善高血压动物模型的胰岛素抵抗[4]。由于骨骼肌是机体进行葡萄糖代谢的主要器官,因此本研究以小鼠成肌细胞(C2C12)为研究对象,通过检测AngII和坎地沙坦对细胞内胰岛素信号通路的影响,进一步探讨坎地沙坦影响改善骨骼肌细胞胰岛素抵抗的分子机制。1材料与方法1.1实验材料小鼠成肌细胞株(C2C12)由北京协和细胞中心提供。坎地沙坦、血管紧张素II和2-脱氧葡萄糖(2-NBDG)购自Sigma公司,M-MLV反转录试剂盒购自Takara公司,Real-timePCR扩增试剂盒购自北京中原公司,p-IRS-1、PI3Kp85及p-Akt单克隆抗体购自Abcam公司,HPR标记的羊抗兔及羊抗鼠IgG购自北京中杉金桥生物技术公司。1.2方法1.2.1C2C12的培养、诱导分化及分组细胞加入含10%胎牛血清的DMEM培养基,置于37、含5%CO2的培养箱中培养,隔日换液,待细胞生长至70%~80%融合时按1:4传代。C2C12细胞达80%左右融合时,移除DMEM10%胎牛血清生长培养基,换用含2%马血清的DMEM培养基诱导分化,每24h换液1次,7d后分化成为成熟骨骼肌细胞。细胞鉴定后进行分组:对照组(C组),DMEM;模型组(M组),AngII0.1M+DMEM;坎地沙坦低剂量组(Can1组),坎地沙坦0.1M+AngII0.1M+DMEM;坎地沙坦中剂量组(Can2组),坎地沙坦1M+AngII0.1M+DMEM;坎地沙坦高剂量组(Can3组),坎地沙坦10M+AngII0.1M+DMEM。1.2.22-NBDG法检测葡萄糖吸收率C2C12培养第8天,细胞换液为无血清DMEM培养基100l。按实验分组依次加入坎地沙坦、AngII和胰岛素(10nmol/L),并使坎地沙坦终浓度符合分组要求。每种药物干预间隔时间为30min,并置于孵箱中。每组6个重复,无细胞为背景组。每孔细胞加入终浓度为150g/ml2-NBDG,孵育1h。室温下,400rpm离心培养板5min。小心吸去上清后每孔加入200l的CellBasedAssayBuffer细胞缓冲液。室温下,400rpm离心培养板5min,再每孔加入100l的CellBasedAssayBuffer细胞缓冲液。立即使用荧光分光光度计读板分析,读出细胞摄取的2-NBDG荧光值。激发光波长485nm,发射光波长535nm。与C组的比值为2-NBDG的摄取量,代表了细胞对胰岛素的敏感性。1.2.3RT-PCR实验诱导成熟的C2C12换无血清DMEM,坎地沙坦、AngII和胰岛素按分组加入,每种药物干预间隔30min,24h后去除培养液,提取各组细胞总RNA,RT-PCR法反转录为cDNA。ISR-1、PI3Kp85和Akt的PCR引物由生工生物工程有限公司合成。引物设计如下:ISR-1上游5'-CTGCCTAGACCCACAGGAG-3’,下游5'-CCCAGCAAGGAAGAGTGAGT-3’;PI3Kp85上游5'-TCCAAATACCAG

参考文献

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