大鼠CB1基因真核表达载体的构建及初步鉴定

作者:刘佳;李晶;严磊;赵婷婷;王慧娟;赖国旗;龙明 刊名:中国药房 上传者:马双田

【摘要】目的:构建大鼠Ⅰ型大麻素受体(CB1)真核基因表达载体,并检测其在细胞中的表达情况。方法:从大鼠海马组织中提取总RNA,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增出CB1基因片段,产物连接到p MD18-T载体上。阳性实验筛选出阳性克隆,经Eco RⅠ、Bam HⅠ双酶切及测序鉴定后,将其连接到载体pc DNA 3.1(+)中,构建质粒载体pc DNA3.1(+)-CB1,脂质体转染原代人胚肾293细胞(HEK293细胞)。用Western blot实验鉴定细胞中CB1蛋白的表达,用免疫荧光细胞染色联合激光扫描共聚焦法检测其在细胞中表达的部位。结果:采用RT-PCR成功获得大鼠CB1基因,PCR扩增得到1 500 bp左右的CB1基因片段,双酶切鉴定及DNA测序证实质粒载体pc DNA3.1(+)-CB1构建成功。Western blot实验、免疫荧光细胞染色联合激光扫描共聚焦法证实载体pc DNA3.1(+)-CB1能在HEK293细胞中表达,且表达产物主要分布在细胞膜表面和细胞质中。结论:构建的pc DNA3.1(+)-CB1表达载体能成功转入真核HEK293细胞,并在细胞膜表面和细胞质中表达CB1蛋白。

全文阅读

2.重庆三峡医药高等专科学校第一附属医院神经外科,重庆404120;3.重庆医科大学实验动物中心,重庆400016)2010,75(2):173.[9]张鑫.雷公藤制剂毒副作用及减毒方法研究进展[J].中国药学杂志,2013,48(22):1897.[10]熊璐琪.糖尿病大鼠皮肤的组织学改变对不同脂溶性的地塞米松经皮渗透与吸收的影响[D].广州:南方医科大学,2011.?大麻素是从印度大麻(Cannabissativa)里发现的一组萜酚类化合物,通过与大麻素受体(Cannabinoidreceptor,CB)作用而发挥生物作用。大麻素受体主要存在于哺乳动物神经和免疫系统中[1],现今已发现两个亚型:型CB(CB1)和型CB(CB2)。CB1主要分布于脑、脊髓与外周神经系统,故又称为中枢型CB,而脑内的CB1主要分布于基底神经节(包括黑质、苍白球和外侧纹状体)、海马癌症(CA)锥体细胞层、小脑和大脑皮质[2]。通过激活CB1可以调节多种神经递质的释放,如多巴胺和-氨基丁酸(GABA)等,这一作用参与了记忆、认知和运动等活动的控制[3]。目前,随着CB及其作用逐渐被人们所熟知,大麻素类药物的研发在世界范围内也成为了一个热点。基于人类与大鼠的CB蛋白的氨基酸序列存在极高的同源性(98%),笔者拟建立能在哺乳动物细胞中稳定表达的鼠源CB1基因真核表达载体,为进一步研究大麻素类药物作用的药理机制和大麻素类新药筛选提供实验依据。1材料1.1仪器Centrifuge5804R高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司);S1000聚合酶链式反应(PCR)仪(美国Bio-Rad公司);FV1200激光扫描共聚焦显微镜(日本Olympus公司)。1.2试剂总RNA提取试剂盒(美国Promega公司,批号:Z3100);逆转录(RT)-PCR试剂盒、T载体连接试剂盒、T4DNA连接酶试剂盒、DL2000DNAMarker、DL5000DNAMarker、DL1000DNAMarker、TaqDNA多聚酶、凝胶回收试剂盒(日本Takara公司,批号分别为:DDR024A、D101A、D2011A、YY10745、l111042、D526A、CK1201CA、D2500-01);限制性内切酶EcoR、BamH(美国NEB公司);质粒提取试剂盒(德国Qiagen公司,批号:12143);LipofectamineTM2000转染试剂(美国Invitro-gen公司);CB1抗体(北京博研科创生物技术公司);HRP(辣根过氧化物酶)标记的羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)(北京中杉金桥生物技术有限公司);荧光标记的羊抗兔IgG(美国Abbkine公司);抗荧光淬灭封片液(上海碧云天生物技术有限公司,批号:P0126);pcDNA3.1(+)真核表达载体由重庆医科大学实验动物中心实验室提供。1.3细胞、菌株与动物清洁级SD大鼠[,体质量(20050)g,生产许可证号:SCXK(渝)20020001]、DH5感受态细菌及原代人胚肾细胞(HEK293细胞)均由重庆医科大学实验动物中心实验室提供。1.4引物设计根据GenBank数据库中大鼠CB1基因NM_012784.4序列设计引物。上游引物:5-CGGGATCCGCCACCATGAAG-TCGATCCTAGATG-3,下游引物:5-GGAATTCCTTTTTCT-GTGCAGCCACAA-3,并在上游引物的5端加上EcoR酶切位点、下游引物的5端加上BamH酶切位点。引物由上海Invitrogen公司合成。2方法2.1SD大鼠脑组织c

参考文献

引证文献

问答

我要提问