中风Ⅱ号对局灶性脑缺血大鼠NF-κB表达的影响

作者:林信富;武一曼;潘晓鸣;陈素娟;施菱;郑雪花;朱亨炤 刊名:时珍国医国药 上传者:高锦雄

【摘要】目的观察中风Ⅱ号对局灶性脑缺血大鼠脑组织核因子-κB(NF-κB))蛋白表达的影响。方法线栓法制备大鼠大脑中动脉缺血(MCAO)模型,予中风Ⅱ号口服液(10 mg·kg-1)连续灌胃1 d、3 d、7 d,并设正常对照组、模型组。Longa法进行神经功能缺损评分,TTC染色检测脑组织缺血面积,Western blot检测大鼠脑组织NF-κB p65蛋白表达。结果模型组大鼠脑组织NF-κB蛋白表达较对照组显著升高,而中风Ⅱ号能明显改善MCAO大鼠神经功能缺损评分,减少脑组织缺血面积,降低脑组织NF-κB蛋白表达。结论中风Ⅱ号可通过抑制NF-κB的过高表达,调控炎症级联反应,减轻局灶性脑缺血大鼠的炎症损伤。

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炎症反应可以抑制神经元再生及脑卒中后功能恢复,是缺血性脑卒中后继发性脑损伤的重要原因[1]。作为多种信号途径共同节点的核因子-B(NF-B)是细胞内重要的转录因子,参与体内多种细胞炎症因子的转录与调节,与炎症反应密切相关。近年研究表明NF-B的激活及其下游促炎细胞因子的释放与脑缺血继发性脑损伤密切相关[2]。本研究通过观察益气活血熄风法中药中风号口服液对MCAO大鼠NF-B表达的影响,探讨其对脑缺血大鼠的脑保护作用机制。1材料1.1动物清洁级SD大鼠42只,雄性,体质量240~300g,由福建医科大学实验动物中心提供,许可证号:SCXK[闽]2012001。1.2药物与试剂中风号口服液由黄芪、党参、当归、地龙、丹参、赤芍、川芎、钩藤、大黄等组成。药材用水煎煮后过滤,浓缩至流浸膏,乙醇醇沉,过滤回收乙醇,最终滤液加水调至含生药量2gml-1,分装灭菌,100ml/瓶,由福建省中医药研究院监制。氯化-2,3,5-三苯基四氮唑(TTC),兔抗大鼠NF-Bp65、-actin抗体(美国SantaCruz公司),辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG抗体,PVDF膜(美国Millipore公司)。2方法2.1分组与给药适应性喂养1周后,按体质量随机抽取6只大鼠作为对照组(A组),其余36只大鼠按照“2.2”项制备MCAO局灶性脑缺血大鼠模型,在手术后2h进行神经功能评分,按评分随机分成模型组(B组)、中风号组(C组),每组各18只,按评分随机分成给药1d、3d、7d3个时间点组,每个时间点组6只。术后第2天开始,B组予生理盐水5mlkg-1灌胃,C组予中风号5mlkg-1灌胃,均为每天2次,按时间点分别灌胃1d、3d、7d,A组不给药。2.2模型制备参照ZeaLonga等[3]线栓法制作大鼠大脑中动脉缺血模型。10%水合氯醛(35mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠,仰卧固定。颈部备皮,消毒,取正中切口。暴露、分离左侧颈总动脉、颈外动脉及颈内动脉。用真丝线依次结扎颈总动脉近心端及颈外动脉,用微型血管夹夹闭颈内动脉。在颈总动脉结扎处上1mm处剪一小切口,插入直径为0.26mm的单丝尼龙线(从颈总动脉分叉处起计算插入18~22mm),松开微型血管夹,缓慢推动尼龙线,使之进入颈内动脉直至感觉有少许阻力为止,固定栓线,逐层缝合颈部切口。术后保持体温。2.3神经功能缺损评分B组、C组动物在手术后2h及处死前参考ZeaLonga[3]神经功能评分方法分别进行神经功能缺损评分。0分:无神经功能障碍;1分:提尾见瘫痪侧前肢回收屈曲不能;2分:除1级体征外,向瘫痪阻力降低;3分:大鼠爬行时向瘫痪侧旋转或倾斜;4分:不能自发行走或处于昏迷状态。2.4TTC法检测脑组织缺血面积各组大鼠分别在术后各时一间点迅速取脑,前脑立即置于-20冰箱冷冻20min,做2mm厚冠状切片,置2%TTC溶液中,37避光孵育30min。白色为梗死灶,红色为正常脑组织。拍照脑片进行图片分析,计算出脑组织缺血面积比值。2.5Westernblot检测NF-Bp65蛋白表达取保存于液氮中脑组织100mg剪碎,RIPA裂解液裂解后冰浴匀浆,12000r/min4离心10min,提取总蛋白,考马斯亮蓝法测定总蛋白浓度。加样量30g样品行10%SDS-PAGE凝胶电泳,采用半干转膜法转膜至PVDF(转膜条件:20v,30min)。5%脱脂奶粉的封闭液室温封闭1h,加兔抗大鼠NF-Bp65(1300)和兔抗大鼠-actin抗体(11000),4反应过夜;TBST洗10minx3次,加辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗

参考文献

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