α-倒捻子素对过氧化氢诱导的人视网膜色素上皮细胞损伤的保护作用

作者:苏途;方圆;谢平;袁松涛;范雯;许译丹;刘庆淮 刊名:国际眼科杂志 上传者:何云开

【摘要】目的:研究α-倒捻子素对过氧化氢(H2 O2)诱导的人视网膜色素上皮细胞株ARPE-19氧化损伤的保护作用。方法:分别用不同浓度的α-倒捻子素和H2O2处理ARPE-19,CCK8法检测α-倒捻子素和H2O2对ARPE-19细胞毒性作用。不同浓度的α-倒捻子素预处理ARPE-19,再用200μmol/L H2O2处理24h,观察细胞活性变化。流式细胞仪检测细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平变化,免疫印迹法(Western blot)检测NF-κB蛋白表达变化。结果:CCK8法检测结果显示:当α-倒捻子素浓度在0~12μmol/L时,ARPE-19活性无明显变化;当浓度达到16μmol/L时,细胞活性开始下降(P<0.05)。H2 O2诱导后,当α-倒捻子素浓度在0~16μmol/L之内时,α-倒捻子素预处理均可提高ARPE-19细胞活性。ROS结果表示:H2O2诱导后,ROS表达量增高(P<0.05);8和12μmol/Lα-倒捻子素预处理,均可有效清除H2O2诱导产生的ROS(P<0.05)。Western blot结果显示:H2O2诱导后NF-κB蛋白表达增高(P<0.05),12μmol/Lα-倒捻子素预处理可以继续上调H2O2诱导后ARPE-19的NF-κB蛋白表达(P<0.05)。结论:H2O2诱导ARPE-19细胞氧化损伤,造成细胞活性下降,ROS表达量增加,经过α-倒捻子素预处理后,可有效提高细胞活性,清除ROS,活化NF-κB。

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0引言年龄相关性黄斑变性(age-relatedmaculardegeneration,AMD)是一种累及黄斑部不可逆的退行性病变,严重损害老年人视力。随着我国人口老龄化,AMD发病率日渐增高[1]。但是AMD的发病机制目前并不十分清楚,多认为其是一种多因素疾病,受个体、环境因素等多方面影响。研究表明,氧化损伤在AMD的发生发展中有重要作用[2-4],更有研究证实,氧化损伤诱导的人视网膜色素上皮细胞(retinalpigmentepithelium,RPE)在AMD发病的分子机制中起到重要作用[2,5]。RPE细胞具有多种重要的生理功能,它位于视网膜最外层,代谢活跃,在一些视网膜疾病,如AMD、视网膜光损伤等易受到氧化损伤[5]。-倒捻子素(1,3,6-三羟基-7-甲氧基-2,8-双(3-甲基-2-丁烯基)-9H-氧杂蒽-9-酮)是从藤黄科藤黄属植物山竹子果壳中分离出来,具有重要的生物活性。现代药理研究表明,-倒捻子素具有抗氧化、抗炎[6]、抗菌[6]、抗癌[8]等多种生物活性。本实验通过建立体外培养的RPE细胞氧化损伤模型,进一步探讨-倒捻子素对RPE细胞氧化损伤的保护机制。1材料和方法1.1材料人视网膜色素上皮细胞株ARPE-19(美国ATCC公司);DMEM/F12培养基,胎牛血清,胰蛋白酶,青霉素和链霉素(美国Hyclone公司)。-倒捻子素、H2O2试剂(美国Sigma公司);CCK8试剂盒(上海翊圣生物科技有限公司)、核蛋白提取试剂盒,苯甲基磺酰氟(Phenylmethanesulfonylfluoride,PMSF)(碧云天生物技术研究所);NF-B单克隆抗体(美国SantaCruz公司);HRP标记羊抗兔二抗(碧云天生物技术研究所)。酶标仪(MolecularDevices公司);流式细胞仪(美国BD公司)。1.2方法1.2.1ARPE-19细胞培养将ARPE-19细胞用含10%胎牛血清和青霉素、链霉素各100U/mL的DMEM/F12培养液,37、体积分数为5%CO2培养箱中培养,接种后第二天换液,以后每两天换液1次,当细胞融合至80%~90%时,用无血清培养液培养24h后用于实验。1.2.2CCK8检测-倒捻子素对ARPE-19细胞的毒性作用将对数期生长的ARPE-19细胞接种至96孔板中,接种密度为8104个/L,待细胞贴壁后,换成含-倒捻子素浓度分别为0,8,12,16,20,30,40mol/L的含10%血清的培养液孵育24h,每浓度5孔。弃去培养液,每孔加入现配置的含10LCCK8的培养液110L,37避光孵育3h左右,用酶标仪在450nm波长处测定吸光度(OD)值,记录结果。公式为:细胞活性(%)=(实验孔OD值-空白孔OD值)/(正常对照孔OD值-空白孔OD值)100%。 表1不同浓度-倒捻子素对ARPE-19细胞活性的影响-倒捻子素浓度(mol/L)细胞活性(%)P0(正常对照组)1008101.6000.5980.27412102.0730.5870.1621695.5372.791a0.0072080.4971.732a0.0003065.2632.501a0.0004041.8971.721a0.000F534.205P0.000aP<0.05vs正常对照组。正常对照孔为正常培养细胞,未予任何处理;空白孔里无细胞,只有含CCK8的培养液。1.2.3H2O2氧化损伤模型的建立将呈对数期生长的ARPE-19细胞接种至96孔板中,密度为8104个/L,贴壁后,加入H2O2浓度分别为0,100,200,400,60

参考文献

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