负载Walker-256肿瘤细胞抗原的树突状细胞疫苗的制备

作者:喻钢;王建 刊名:实用癌症杂志 上传者:杨明山

【摘要】目的制备负载大鼠Walker-256肿瘤细胞抗原的树突状细胞(DC)疫苗,为进一步研究打下基础。方法从大鼠骨髓细胞中利用粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介导素4(IL-4)在体外定向诱导分化出DC,以液氮冻融法制备肿瘤抗原刺激DC制备肿瘤疫苗。ELISA检测培养液中IL-12的浓度。结果得到大量具备典型光镜和电镜形态特征的DC,表达大鼠DC特异性标志OX62。负载抗原前后DC产生IL-12的水平存在明显差异(P<0.05)。结论负载Walker-256肿瘤抗原的树突状细胞疫苗制备成功,具有促进Th1极化的潜能。

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机体的抗肿瘤作用以Th1介导的细胞免疫为主,树突状细胞(dendriticcell,DC)则是唯一能激活未致敏T细胞并诱导其极化的抗原提呈细胞(antigen-pres-entingcells,APC)[1]。用肿瘤抗原刺激未成熟的树突状细胞,并使之成熟,理论上能够诱导更多抗原特异性的Th1细胞,从而发挥抗肿瘤作用。因此,我们以大鼠骨髓单核细胞为来源,体外诱导DC,并使之负载Walker-256肿瘤细胞抗原,制成抗肿瘤疫苗,为以后的研究打下基础。1材料和方法1.1实验动物和细胞株成年雄性SD大鼠,体重200~250g由徐州医学院实验动物中心提供;大鼠Walker-256肿瘤细胞株由南京中医药大学药理毒理实验室提供。1.2主要试剂重组大鼠白介素4(rrIL-4),重组大鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rrGM-CSF),重组大鼠肿瘤坏死因子(rrTNF-)为美国Peprotech公司产品;胎牛血清为美国MDgenics公司产品;大鼠淋巴细胞分离液购于中科院生物工程医学研究所;Histostain-DC试剂盒为美国Zymed公司产品;大鼠IL-12p70ELISA试剂盒,购于上海西唐生物科技有限公司。1.3体外定向诱导大鼠DC取健康雄性成年SD大鼠,断颈处死,浸入75%的乙醇中消毒10min。无菌手术取出双侧股骨和胫骨,剥净肌肉组织,用无菌注射器抽取5mlPBS,将其针头分别从两端插入骨髓腔,反复冲洗出骨髓直至骨变白。实用癌症杂志2008年7月第23卷第4期ThePracticalJournalofCancer,July2008,Vol23,No.4采用密度梯度离心法获取髓单核细胞,每只大鼠可提取髓单核细胞(2.0~3.0)107个。用含10%胎牛血清的RPMI1640完全培养液重悬细胞,将细胞悬液接种于2个50ml培养瓶中,每瓶10ml,加入rrGM-CSF10g/L,rrIL-410g/L,置于37.0、5%CO2培养箱中培养。每2天半量换液1次并补加细胞因子1次。1.4快冻慢融法获取Walker-256肿瘤细胞抗原及抗原的负载复苏Walker-256冻存细胞,用4mlPBS重悬,注入4只健康雌性SD大鼠腹腔内,每只1ml,7天后可见腹水形成。抽取接种Walker-256细胞的传代大鼠腹水10ml,1000r/min离心10min,弃上清,PBS洗2次。用8mlPBS重悬细胞,加入5ml无菌冻存管中,每管4ml,共2管,放入液氮中。沸腾停止10min后,取出冻存管,在室温下缓慢融化。待其完全融化后,再放入液氮中,反复3次。将冻存管中的液体分置入1.5ml无菌EP管中,10000r/min离心30min,收集上清,即为抗原溶液,测得蛋白浓度为9.33g/L,将抗原溶液置入-80冰箱中冻存。培养细胞至第6天,换液补加细胞因子后,取出抗原溶液,37.0水浴中融化,按照0.3g/L的浓度加入培养瓶中,使每瓶抗原总含量为3mg瓶/,并加入TNF-20g/L,第8天收获的细胞为DC疫苗。1.5DC的鉴定DC形态学鉴定:倒置显微镜观察DC不同阶段的生长特点;透射电镜观察树突状细胞,收集第8天的已添加抗原的DC,常规法制备样品。免疫双染试剂盒检测大鼠DC表面标志OX62及OX6。1.6ELISA检测添加抗原前后的培养液中的IL-12p70反复4次提取大鼠髓单核细胞,体外培养诱导DC。收集每瓶细胞添加抗原前的第6天和添加抗原后的第8天的培养液,ELISA检测培养液中的IL-12p70浓度,作配对分析。1.7数据处理采用SPSS15.0统计软件进行统计分析,数据以x-

参考文献

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