靶向survivin基因的siRNA真核表达载体的构建及鉴定

作者:李红;李明红;缪书卉;杨桦;镡旭民 刊名:重庆医学 上传者:沈凯

【摘要】目的构建靶向survivin基因的siRNA的表达载体,研究survivin在喉癌中的作用机制。方法根据基因库上sur-vivin cDNA序列,设计合成靶基因序列,将其寡核苷酸退火后插入到Pgenesil-1表达载体中,对该重组表达载体进行酶切鉴定及DNA测序。结果酶切鉴定、DNA测序证实表达质粒构建成功,无碱基突变。结论成功构建了靶向survivin基因表达的siR-NA干扰质粒载体Pgenesil/survivin,为进一步运用RNA干扰技术进行survivin基因功能研究奠定了基础。

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survivin是凋亡蛋白抑制因子(IAPs)家族的成员,因其对细胞凋亡调控作用备受重视,同时由于其在很多人类恶性肿瘤细胞中信号表达增高,而在多数正常组织不表达的特异性,近年来受到肿瘤研究者们的重点关注。在基因研究过程中,RNA干扰(RNAi)技术是近年来迅速发展起来的一项新的基因干扰技术,通过将具有一定结构特点的、一定长度的双链小RNA分子,即小干扰RNA(siRNA)导入细胞,发现可特异性降解与其序列具有同源性的mRNA分子,导致靶向基因的表达抑制。在此基础上,本研究利用分子克隆技术,构建了针对喉癌细胞中survivin基因表达的小分子干扰质粒载体,该载体的构建为下一步采用RNA干扰进行survivin基因功能研究奠定了基础。1材料与方法1.1材料大肠杆菌DH5和表达质粒Pgenesil-1均购自晶赛公司,DNA凝胶纯化试剂盒、质粒抽提试剂盒购自Qiagen公司,TaqDNA聚合酶和逆转录试剂盒购自Promega公司,限制性内切酶BamH和Hind酶,引物、siRNA模板序列由武汉晶赛公司合成。1.2人survivin基因干扰序列的获得从GeneBank中检索人survivin基因全长cDNA序列(GenBank序列进入号NM_001168GI:59859877),自行设计靶向survivin的siRNA序列survivin1:GGACCACCGCATCTCTACA。survivin1-1:5-GATCCGGACCACCGCATCTCTACATTCAAGACGTGTAGAGATGCGGTGGTCCTTTTTTGAATTCA-3;survivin1-2:3-GCCTGGTGGCGTAGAGATGTAAGTTCTGCACATCTCTACGCCACCAGGAAAAAACTTAAGTTCGA-5。survivin2:GCATTCGTCCGGTTGCGCT。survivin2-15-GATCCGCATTCGTCCGGTTGCGCTTTCAAGACGAGCGCAACCGGACGAATGCTTTTTTGAGCTCA-3;survivin2-2:3-GCGTAAGCAGGCCAACGCGAAAGTTCTGCTCGCGTTGGCCTGCTTACGAAAAAACTCGAGTTCGA-5。survivin3:GGCTGGCTTCATCCACTGC。survivin3-1:5-GATCCGGCTGGCTTCATCCACTGCTTCAAGACGGCAGTGGATGAAGCCAGCCTTTTTTGTCGACA-3;survivin3-2:3-GCCGACCGAAGTAGGTGACGAAGTTCTGCCGTCACCTACTTCGGTCGGAAAAAACAGCTGTTCGA-5。HK:GACTTCATAAGGCGCATGC。HK-1:5-GATCCGACTTCATAAGGCGCATGCTTCAAGACGGCATGCGCCTTATGAAGTCTTTTTTGTCGACA-3;HK-2:3-GCTGAAGTATTCCGCGTACGAAGTTCTGCCGTACGCGGAATACTTCAGAAAAAACAGCTGTTCGA-5。siRNA的正义链与反义链,中间以9个脱氧核苷酸的Loop结构相连,后面接有RNApoly聚合酶转录中止位点,同时模板链两端分别设计BamH和Hind酶切位点。随之将DNA模板单链1(浓度1g/L)1L和DNA模板单链2(浓度1g/L)各1L加入20SSC1L和H2O17L中形成20L反应体系,混匀,95加热10min,取出置室温1h,退火,便得到双链DNA插

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