突变型人胰岛素原基因的克隆及其腺病毒载体的构建

作者:石琳;陈振萍;袁向飞;杨少光;张宇光;韩忠朝 刊名:细胞与分子免疫学杂志 上传者:季建锋

【摘要】目的:构建含有定点突变的人胰岛素原基因的腺病毒表达载体。方法:首先利用RT-PCR方法从正常流产胎儿胰腺组织获取野生型人胰岛素原cDNA;然后通过重叠延伸PCR方法在人胰岛素原cDNA上产生2个突变位点,使突变的cDNA编码的蛋白质含弗林蛋白酶的识别位点,该突变型胰岛素原cDNA片段命名为INS-M2;最后将INS-M2亚克隆至腺病毒载体系统的穿梭载体的多克隆位点上,并与骨架载体共转染至细菌内,通过细菌内同源重组得到重组载体。结果:Hind Ⅲ和Xho I酶切、Pac I酶切及测序均证实载体pAd-INS-M2构建成功。结论:构建的含定点突变人胰岛素原基因腺病毒载体pAd-INS-M2为进一步转染非胰岛β细胞,对糖尿病进行基因治疗奠定了基础。

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糖尿病已成为仅次于心脑血管病症和癌症的第三大致死疾病,胰岛素是治疗糖尿病的主要药物,但由于随时需要注射胰岛素,给患者带来了极大的不便,对糖尿病的基因治疗成为了可能。随着分子生物学领域取得的迅猛发展,特别是重组DNA技术的建立[1],我们通过重叠延伸PCR技术对胰岛素原基因进行2个位点的突变,将人胰岛素原基因cDNA上B-C链连接处的碱基序列LysThrArgArg及C-A链连接处的LeuGlnLysArg分别突变为ArgThrLysArg及ArgGlnLysArg序列,以使其可以被弗林蛋白酶识别[2]。然后将突变型的人胰岛素原基因构建到腺病毒载体中,使其有望成为糖尿病基因治疗理想的候选载体之一,并为进一步进行人胰岛素原基因转染非胰岛细胞,使之产生胰岛素治疗糖尿病奠定基础。1材料和方法1.1材料PCR产物胶回收试剂盒、限制性内切酶Hind、XhoI、ProbestDNA聚合酶、SimpleTVector、DNAmarker均购于大连宝生物公司;T4DNA连接酶、M-MLV逆转录酶购于Invitrogen公司;限制性内切酶PmeI、PacI购于NEB公司;质粒DNA抽提试剂盒购于赛百盛;引物由上海生物工程有限公司合成;pAdEasy-1载体系统、DH5菌株、BJ5183菌均由血研所中法实验室保存。1.2方法1.2.1引物设计根据GenBank发表的人胰岛素原基因cD-NA序列,综合利用Primer5和Oligo6引物设计软件设计人胰岛素原基因全长的引物,INS1:5-GCTCTCGAGGCCACCATGGCCCTGTGGAT-3;INS2:5-GAGAAGCTTGCTGCGTCTAGTTGCAGTAGT-3,划线部分为酶切位点(XhoI和HindIII)。再根据PCR定点突变原理,分别在人胰岛素原基因B-C链及C-A链连接处进行2次突变,突变引物设计如下:INS3:5-TTCTTCTACACACCCCGGACCCGC-3;INS4:5-GCGGGTCCGGGGTGTGTAGAAGAA-3;INS5:5-GTCCCGGCAGAAGCGTGGCATTGT-3;INS6:5-ACAATGCCACGCTTCTGCCGGGAC-3;斜粗体划线部分为突变的位点。1.2.2野生型人胰岛素原基因的获得取胎龄5个月的经水囊引产的健康胎儿胰腺组织,液氮中冷冻过后用DEPC处理过的研钵研磨,然后加入TRIzol抽提总RNA,以提取的总RNA经逆转录后合成的cDNA为模板,以引物INS1和INS2进行PCR反应。反应条件:94,预变性5min;变性、退火及延伸条件分别是9430s,6030s,7230s,共进行30次循环;最后72延伸10min。PCR产物经10g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。将PCR产物克隆至T载体上进行筛选、扩增及鉴定,并送测序公司测序。1.2.3突变型人胰岛素原基因的获得采用重叠延伸PCR法,使人胰岛素原基因产生两处突变。以获得的野生型人胰岛素原基因为模板,首先进行B链/C肽连接处的突变。用引物INS1、INS4和引物INS3、INS2分别扩增出两段PCR产物,利用引物INS3和INS4的互补部分使这两段PCR产物互为模板和引物,在DNA聚合酶的作用下延伸出整条人胰岛素原基因,然后再加入引物INS1和INS2继续扩增含有第一个突变的人胰岛素原基因(命名为INS-M1),将扩增产物连接到T载体中,并送测序公司测序鉴定。第二处突变在C肽与A链的连接处。以经测序第一处突变改造成功的人胰岛素原基因为模板,用引物INS1、INS6和引物INS5、INS2经过以上同样的

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