突变型人胰岛素原基因的克隆及其腺病毒载体的构建

作者:石琳;陈振萍;袁向飞;杨少光;张宇光;韩忠朝 刊名:细胞与分子免疫学杂志 上传者:季建锋

【摘要】目的:构建含有定点突变的人胰岛素原基因的腺病毒表达载体。方法:首先利用RT-PCR方法从正常流产胎儿胰腺组织获取野生型人胰岛素原cDNA;然后通过重叠延伸PCR方法在人胰岛素原cDNA上产生2个突变位点,使突变的cDNA编码的蛋白质含弗林蛋白酶的识别位点,该突变型胰岛素原cDNA片段命名为INS-M2;最后将INS-M2亚克隆至腺病毒载体系统的穿梭载体的多克隆位点上,并与骨架载体共转染至细菌内,通过细菌内同源重组得到重组载体。结果:Hind Ⅲ和Xho I酶切、Pac I酶切及测序均证实载体pAd-INS-M2构建成功。结论:构建的含定点突变人胰岛素原基因腺病毒载体pAd-INS-M2为进一步转染非胰岛β细胞,对糖尿病进行基因治疗奠定了基础。

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!竖塑!塑!=!Z!§墅!堕皇坌王鱼瘗堂盘查(g!i旦』垦!!!丛!!!塑塑!!!!毯塑!:丝(三2 ·论著· 529 文章编号:1007—8738(2008)05-0529—03 突变型人胰岛素原基因的克隆及其腺病毒载体的构建 石琳,陈振萍,袁向飞,杨少光,张宇光,韩忠朝事 (中国医学科学院中国协和医科大学血液学研究所血液病医院,天津300020) [摘要】 目的:构建含有定点突变的人胰岛素原基因的腺病毒表达载体。方法:首先利用RT-PCR方法从正常流产胎儿胰腺组织获取野生型人胰岛素原eDNA;然后通过重叠延伸PCR方法在人胰岛素原eDNA上产生2个突变位点,使突变的eDNA编码的蛋白质含弗林蛋白酶的识别位点,该突变型胰岛素原eDNA片段命名为INS.M2;最后将INS-M2亚克隆至腺病毒载体系统的穿梭载体的多克隆位点上,并与骨架载体共转染至细菌内,通过细菌内同源重组得到重组载体。结果:HindⅢ和Xho I酶切、Pac I酶切及测序均证实载体pad-INS.M2构建成功。结论:构建的含定点突变人胰岛素原基因腺病毒载体pAd.INS.M2为进一步转染非胰岛B细胞, 对糖尿病进行基因治疗奠定了基础。 [关键词]胰岛素原;腺病毒载体/pAdEasy-1;弗林蛋白酶 [中图分类号]Q782 [文献标识码]A 糖尿病已成为仅次于心脑血管病症和癌症的第三大致死疾病,胰岛素是治疗糖尿病的主要药物,但由于随时需要注射胰岛素,给患者带来了极大的不便,对糖尿病的基因治疗成为了可能。随着分子生物学领域取得的迅猛发展,特别是重组DNA技术的建立¨J,我们通过重叠延伸PCR技术对胰岛素原基因进行2个位点的突变,将人胰岛素原基因eDNA上 B—C链连接处的碱基序列Lys Thr Arg Arg及c—A链连接处的Leu Gin Lys Arg分别突变为Arg Thr Lys Arg及Arg Gin Lys Arg序列,以使其可以被弗林蛋白酶识别旧J。然后将突变型的人胰岛素原基因构建到腺病毒载体中,使其有望成为糖尿病基因治疗理想的候选载体之一,并为进一步进行人胰岛素原基因转染非胰岛B细胞,使之产生胰岛素治疗糖尿病奠定基础。 1材料和方法 1.1材料PCR产物胶回收试剂盒、限制性内切酶HindⅢ、 Xho I、Probest DNA聚合酶、Simple T Vector、DNA marker均购于大连宝生物公司;T4 DNA连接酶、M-MLV逆转录酶购于Invitrogen公司;限制性内切酶P榭I、Pac I购于NEB公 收稿日期:2007一ll一27;接受日期:2008一Ol一28 作者简介:石琳(1980一),女,河北河间人,在读博士 Tel:022-83719876-8062;E—mail:shilin0609@126.corn 术Corresponding autllor 司;质粒DNA抽提试剂盒购于赛百盛;引物由上海生物工程有限公司合成;pAdEasy.1载体系统、DH5ct菌株、BJ5183菌均由血研所中法实验室保存。 1.2方法 1.2.1 引物设计根据GenBank发表的人胰岛素原基因cD— NA序列,综合利用Primel5和Oli906引物设计软件设计人胰岛素原基因全长的引物,INSl:5 7-GCT CTC GAG GCC ACC ATG GCC CTG TGG AT-3 7;INS2:5'-GAG垒△堡垦卫GCT GCG TCT AGTTGC AGT AGT-3’,划线部分为酶切位点(Xho I和 Hind III)。再根据PCR定点突变原理,分别在人胰

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