靶向EphB4基因的shRNA真核表达载体的构建与鉴定

作者:张艳荣;董万利;胡锦;惠国桢 刊名:苏州大学学报(医学版) 上传者:开恒祝

【摘要】目的构建和鉴定靶向EphB4基因的短发夹RNA(shRNA)真核表达载体。方法体外合成一对互补并编码靶向EphB4基因的特异性shRNA序列的寡核苷酸,克隆到经Bbs I酶切线性化的psiRNA人H1启动子质粒载体中,经酶切和测序鉴定所构建的重组载体是否正确;采用脂质体转染的方法将构建的重组载体导入人恶性胶质瘤细胞系U251中,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测转染细胞EphB4mRNA的表达变化。结果经酶切和测序证明,pH1-EphB4-shRNA序列正确;转染pH1-EphB4-shRNA载体后,U251细胞EphB4基因的电泳条带明显减弱,在磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)参比下较空载体组下降60%。结论靶向EphB4基因的shRNA真核表达载体构建成功,转染U251细胞之后获得稳定表达,并可特异性沉默EphB4基因的表达,为进一步研究EphB4基因在恶性胶质瘤的发生发展中的作用提供了实验基础。

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肿瘤的发生、发展是一个复杂的多步骤过程,涉及到各种各样的细胞信号传导的异常,如血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)、缺氧诱导因子(hypoxiainduciblefactor,HIF)及Eph(erythropoietin-producinghumanhepato-cellular)受体酪氨酸激酶等多种异常信号传导。近年来发现,Eph受体酪氨酸激酶家族成员的异常表达在肿瘤的恶性进展中具有重要作用。有报道其成员EphB4异常表达于子宫内膜癌[1]、前列腺癌[2]、恶性间皮瘤等[3]、胶质瘤等[4]。与正常间皮细胞相比,EphB4高表达于恶性间皮瘤细胞系及原发的肿瘤组织,并且应用siRNA技术和反义寡核苷酸技术下调EphB4的表达,可减弱肿瘤细胞的存活力,降低侵袭和转移能力[3]。RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是转录后基因沉默现象,能有效且特异地沉默靶基因的表达。我们通过构建特异性抑制EphB4基因的短发夹RNA(shorthairpin,shRNA)表达载体,并导入人胶质瘤细胞系U251中,以期抑制该基因的表达,为进一步探讨EphB4在胶质瘤的发生和恶性进展中的作用奠定实验基础。1材料与方法1.1主要试剂质粒psiRNA-H1由中国科学院上海生化细胞研究所提供,大肠杆菌GT116、氨苄青霉素、LB培养基从中国科学院上海生化细胞研究所引进,限制性内切酶Ase购自美国NEB公司,限制性内切酶Bbs、T4DNA连接酶、BIOWESTAgarose购自Gene公司,琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自天根生化科技有限公司。1.2方法1.2.1靶向EphB4基因的寡核苷酸合成GeneBank查找编码人EphB4cDNA的序列,应用Invit-rogen公司RNAi设计软件并参考文献[4],进行全基因扫描和序列分析,根据siRNA设计的原则寻找符合特征的靶位点,应用BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)技术在基因库中确认没有与选中的mRNA序列同源的基因,以保证靶基因具有序列特异性。选定的靶位点为5’-GGUGAAUGUCAAGACGCUGUU-3’,据此合成的寡核苷酸为:正义链:5’-TCCCAGGTGAATGTCAAGACGCTGCCACCCAGCGTCTTGACATTCACCTT-3’;反义链:5’-CAAAAAGGTGAATGTCAAGACGCTGGGTGGCAGCGTCTTGACATTCACCT-3’。其中带下划线为与EphB4同源的相互互补的基因序列,中间5nt为茎环区(loop),并在5’端引入正义链为TCCC、反义链为CAAA的黏性末端,与Bbs酶切相匹配。此编码特异shRNA的寡核苷酸对由上海Invitrogen生物技术有限公司合成。1.2.2寡核苷酸与psiRNA-H1质粒的连接(1)寡核苷酸链退火形成双链DNA:将合成的寡核苷酸溶解在双蒸水(ddH2O)中,至终浓度为25mol/L,各取2l寡核苷酸链溶液,补水至终体积为30l。80下水浴2min,然后停止加热,冷却至35。(2)质粒psiRNA的处理:因寡核苷酸合成中在其两端引入了BbsI酶切位点,在psiRNA的多克隆位点中也有BbsI的酶切位点,故用BbsI酶切psiRNA-H1质粒使其线性化,反应体积为20l,37下过夜。用1%的琼脂糖凝胶进行电泳,在凝胶成像系统的紫外线灯下,割下2640bp的大片段,用凝胶回收试剂盒回收,获得双酶切线性的psiRNA-H1质粒。(

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