高效液相色谱梯度洗脱法测定胸腺五肽原料药中醋酸和三氟醋酸的含量

作者:鞠祖芳 刊名:医学信息(中旬刊) 上传者:李光喆

【摘要】目的:运用高效液相色谱方法测定胸腺五肽原料药中醋酸及三氟醋酸的残留量。方法:采用大连依利特ODSC18-BP(5μm4.6×250mm)色谱柱;pH3.0磷酸盐缓冲液及甲醇为流动相,进行梯度洗脱;流速为1.0mL·min-1;检测波长210nm;柱温为25℃。结果:该方法中醋酸和三氟醋酸的分离度符合要求;醋酸的最低检测限10.5ng,三氟乙酸最低检测限14.8ng;样品中未检出醋酸和三氟醋酸残留。结论:该方法可行,对胸腺五肽的质量控制有一定的意义。

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胸腺五肽(TP-5)是胸腺生成素(Thymopoietin)第3236位的氨基酸残基片段,它的基本序列为H-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH。这段只占其母体长度10的片段仍保留了胸腺生成素的有效生物活性,有着与胸腺生成素相同的全部生理功能。有关TP-5的生物活性和免疫功能国内外已有许多报道。正是因为TP-5有着良好的药效作用,所以它有着很好的市场前景。国内外研究开发的胸腺五肽制剂均为冻干粉针“注射用胸腺五肽”,其疗效相对稳定。胸腺五肽原料药中国药典尚未收载,现自行研制胸腺五肽原料药用于质量研究。由于在合成过程中使用了醋酸和三氟乙酸,根据《中国药典》(2010年版)规定,参考《英国药典》附录中醋酸的测定方法,根据醋酸与三氟乙酸酸性强弱不同,将流动相比例稍作调整,采用高效液相色谱法使两者在同一色谱条件下达到有效分离。1.仪器与试药WatersAlliance2695HPLC、UV检测器、WatersEmpower色谱管理系统;METTER天平;甲醇为色谱纯,磷酸及氢氧化钠为分析纯,醋酸及三氟醋酸对照品为三氟醋酸分析纯,经重蒸,水为超纯水。2.实验方法与结果2.1色谱条件。使用大连依利特ODSC18-BP(5um,4.6mm250mm)色谱柱;流动相A为pH3.0磷酸盐缓冲液(精密量取磷酸0.7ml至1000ml量瓶中,加水定容,用10%NaOH调节至pH3.0),流动相B为甲醇。流速为1.0mLmin-1;检测波长为210nm;柱温为25;进样量为10l。按(表1)进行梯度洗脱。2.2溶液的配制。2.2.1醋酸储备液的配制。精密量取冰醋酸0.5ml至100ml容量瓶中,用水稀释并定容至刻度制成浓度为5.25mg/ml的醋酸储备液(按500ml相当于525克醋酸计算)。2.2.2三氟乙酸储备液的配制。精密量取经重蒸后的三氟乙酸1.0ml至100ml容量瓶中,用水稀释并定容至刻度制成14.80mg/ml表1流动相梯度洗脱程序Table1ElutionprogramofmobilephaseTime/min0101015152828333345MobilephaseA%98985050509898MobilephaseB%2250505022ElutionIsocraticLineargradientIsocraticLineargradientIsocratic的三氟乙酸储备液(按相对密度1.480g/ml计算)。2.2.3对照品溶液的配制。精密量取醋酸储备液0.4ml和三氟乙酸储备液0.2ml至100ml容量瓶中,用水稀释并定容至刻度制成对照品溶液。其中醋酸浓度为:21.0ug/ml,三氟乙酸浓度为29.6ug/ml。2.2.4样品溶液的配制。分别精密称取自制四批胸腺五肽供试品适量,加水溶解并制成每1ml约20mg的溶液。2.3分离度。在上述色谱条件下,取对照品溶液进样10ul。由谱图(见图1)可以看出,醋酸和三氟醋酸峰能较好分离。其中:三氟乙酸出峰时间为4.458min;醋酸出峰时间为6.117min。2.4最低检测限。在上述色谱条件下,按信噪比为3:1对最低检测限进行测定,结果表明:当对照品溶液稀释20倍时,进样10ul,主产物峰信号约为噪声的3倍。即醋酸最低检测限为21.0ng/ul10ul20=10.5ng,三氟乙酸最低检测限为29.6ng/ul10ul20=14.8ng。2.5精密度。在上述色谱条件下,取对照品溶液,连续进样5次,计算醋酸及三氟醋酸峰面积的RSD,结果分别为0.9%和1.2%,表明仪器的精密度符合要求。2.6醋酸和

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