miR-17对靶基因转化生长因子受体β_2的负性调控表达

作者:赵洋;张魁;董然 刊名:中华实用诊断与治疗杂志 上传者:张玉灵

【摘要】目的探讨miR-17在HEK293T细胞中对转化生长因子受体β2(transforming growth factor receptor beta 2,TGFRβ2)的调控作用。方法采用生物学信息预测软件对miRNA-17的靶基因进行预测,选定TGFRβ2为靶基因,构建pCDNA3.1+miRNA-17重组表达载体。将HEK293T细胞分为3组,分别为对照组(无转染)、空载组(转染空质粒)和miR-17组(转染pcDNA3.1-GW/EmGFP-miR-17质粒),3组采用实时定量PCR检测miRNA-17和TGFRβ2mRNA表达水平,采用Western blot检测TGFRβ2蛋白表达水平。将HEK293T细胞再分为3组,分别为CTL组(转染miR-17无义寡核苷酸序列)、miR-17组(转染pcDNA3.1-GW/EmGFP-miR-17质粒)和ASO-miR-17组(转染miR-17反义寡核苷酸序列),采用免疫荧光法检测各组TGFRβ2荧光强度。结果转染24h后,空载组和miR-17组HEK293细胞处于对数生长期,细胞突起和包体均正常,与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);miR-17组miR-17表达量(5.391±0.053)明显高于空载组(1.654±0.075)与对照组(1.436±0.038),TGFRβ2mRNA和蛋白表达量(2.449±0.092、1.030±0.030)明显低于空载组(6.135±0.058、5.550±0.040)和对照组(6.862±0.074、5.090±0.030)(P<0.05);ASO-miR-17组TGFRβ2荧光强度(1.144±0.079)明显高于CTL组(0.776±0.044)和miR-17组(0.917±0.096)(P<0.05)。结论 miR-17可负性调节靶基因TGFRβ2的表达。

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随年龄增长,心脏瓣膜可发生退行性病变,其与心脏瓣膜组成结构的脂质、蛋白分布异常和钙化相关[1]。转化生长因子受体(transforminggrowthfactorreceptorbeta,TGFR)与心脏瓣膜病的发生、发展有密切联系[2-3]。TGFR2失调表达导致瓣膜骨性结构家族与心血管疾病的发生密切相关[4]。miRNA-17~92家族包括miR-17-5p、miR-18a-5p、miR-19a-3p、miR-20a-5p,其中miR-17-5p又称为miR-17[5]。在心脏瓣膜发育过程中miRNA-17~92调控骨形成蛋白表达,骨形成蛋白下调可引起心脏瓣膜结构破坏[6]。本研究探讨miR-17在HEK297T细胞中对TGFR2的调控作用,报道如下。1材料与方法1.1一般材料HEK293T细胞(上海博谷生物有限公司,北京);LipofectamineTM2000Reagent(Invitrogen公司,美国),UltrapureAgarose(GIBCO?,美国),引物合成(华大基因研究中心有限公司,北京)、RNasin(Promega,美国),TGFBR2抗体、TGFR2抗体(Abcam公司,美国)。1.2方法1.2.1细胞培养取HEK293T细胞置于含体积分数10%胎牛血清的RPMIDMEM培养液,在37、体积分数5%CO2孵箱中培养,每2~3d换液1次,待细胞融合70%~80%时,用质量分数0.25%胰酶消化传代,取对数生长期细胞用于后续试验。HEK293T细胞分为对照组、空载组和miRNA-17组。其中对照组无转染,空载组转染空质粒,miRNA-17组转染pcDNA3.1-GW/EmGFP-miR-17质粒。1.2.2靶基因载体的构建应用生物信息学软件TargetScan、Miranda和PicTar对miRNA-17进行靶基因预测。增强型绿色荧光蛋白cDNA用限制性内切酶消化并亚克隆成pcDNA3.1,用人脑cDNA数据库克隆成含miRNA-17预测靶点的TGFR2的3UTR,即pcDNA3.1/EGFP,进一步应用BamHIandEcoRI设计成合适核苷酸长度。1.2.3miR-17真核表达载体的构建生物学软件预测靶基因序列和已知miRNA-17基因序列。目的片段经T-A克隆后筛选正确序列,将其亚克隆到pcDNA3.1(+)上,然后进行酶切鉴定和测序分析其正确性。将构建成功的重组质粒pcDNA3.1(+)-miRNA-17转染HEK293T细胞,采用实时定量PCR法检测成熟miRNA-17表达水平。反应条件:372min;955min,9430s,551min,40个循环;7030s。采用SYBRGreen染料法,以GAPDH为内参,采用Ct法对测量值进行计算。1.2.4细胞转染与反义寡核苷酸技术细胞常规培养于含体积分数10%FBS胎牛血清培养基中,37、体积分数5%CO2,每2~3d用质量分数0.25%胰酶消化传代培养。将HEK293T细胞再分为CTL组、miR-17转染组和ASO-miR-17组。其中CTL组转染miR-17无义寡核苷酸序列,miR-17组转染pcDNA3.1-GW/EmGFP-miR-17质粒,ASO-miR-17期的细胞消化,以2105个/mL接种至6孔板,继续培养24h待细胞长至培养板70%融合时转染,48h后裂解细胞并提取蛋白,采用F-4500fluorescencespectrophotometer-HITACH检测各组绿色荧光蛋白的吸光度值作为绿色荧光蛋白的相对表达水平。miRNA反义核酸(miR

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