槲皮素对四氯化碳致建鲤肝细胞损伤的保护作用

作者:刘英娟;申玉金;杜金梁;曹丽萍;贾睿;殷国俊 刊名:农业生物技术学报 上传者:邢卫斌

【摘要】本研究旨在探讨槲皮素(quercetin,QC)对化学性肝细胞损伤的保护作用。1,1-二苯基-2-苦基苯肼基自由基(1,6-Bis(diphenylphosphino)hexane,DPPH)在本实验中用来测定槲皮素的自由基清除能力。8mmol/L四氯化碳(CCl4)用作体外诱导剂,构建建鲤(Cyprinus carpio)肝细胞损伤模型。原代培养的肝细胞分别用不同浓度的槲皮素(0.05、0.1和0.2 mg/mL)进行前处理,后处理及前后处理,检测培养上清指标酶((谷草转氨酶(aspartate transaminase,GOT)、谷丙转氨酶(alanine transaminase,GPT)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenas,LDH))及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD))的酶活性及丙二醛(malondialdehyde,MDA)的释放量,实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,qRT-PCR)法测定细胞中细胞色素P450 1A(CYP1A)、3A(CYP3A)及白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)及诱导型一氧化氮合酶(iNOS)m RNA表达量,Western blot测定核转录因子-κB(NF-κB)成员c-Rel和p65的蛋白表达量。结果显示,低浓度的QC即可高效地清除DPPH,表明QC具有较强的自由基清除能力。QC可以显著提高细胞活力及SOD活性,且有效地降低了GOT、GPT、LDH和MDA的含量;同时,QC也显著地抑制了CYP1A和CYP3A的表达,对c-Rel和p65及其下游细胞因子的转录也起到了显著的抑制作用。数据统计分析显示,前处理组效果最佳,前后处理组效果次之,后处理组稍差,各组中0.1和0.2 mg/m L槲皮素的抑制效果最明显。综合以上结果,QC对建鲤化学性肝损伤有一定的保护作用。实际生产中,可将槲皮素开发成一种饲料添加剂,以增加水产动物的抗病能力。

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在过去的几十年间,中国的水产养殖业开始迅临的主要挑战。猛发展,然而养殖过程中面临的各种鱼病问题阻滞经活体动物分离得到的原代培养细胞因实验了水产业的进一步发展。在密集型池塘养殖系统时间短,受试动物数量少及其他因素干扰少等特中,大量的抗生素及各种化学试剂被用来防治多种点,已广泛应用于体外毒理及药理学的研究(贾睿疾病,使得养殖鱼类长期暴露于各种外源化学物质等,2011)。原代肝细胞代谢功能与体内肝细胞相中(Cabello,2006)。肝脏是鱼类的主要解毒器官,似,具有较高的代谢活性,能较好地反映物质在体大部分的外源及内源性物质在肝脏内进行代谢,因的代谢情况,因此常被用作研究肝毒物代谢及保肝此极易受到多种肝毒物的损害。研究表明,许多化药物活性的模型(贾睿等,2012;郭秋平等,2014)。学物质可以导致鱼类的肝损伤(贾睿等,2012;Ar-本实验选用原代培养的建鲤(Cyprinuscarpio)肝细noldetal.,1996;Weberetal.,2003)。近年来,以肝胞作为实验材料,有利于研究外源化学物质的肝细胆体积及颜色异常为特征的“肝胆综合症”频繁被胞毒性及保肝药物的筛选。报道,这是一种非传染性疾病,发病率高,影响面积近年来,有关中草药提取物或其复合剂在肝脏广,严重地影响了水产养殖的经济效益(李斌等,疾病的防治方面的研究被陆续报道(曹丽萍等,2011)。目前还没有有效治疗该疾病的药物,因此,2012;王志远等,2012)。槲皮素(quercetin)是一种探寻治疗鱼类肝胆疾病的有效药物成为研究者面多羟基黄酮类化合物,广泛存在于植物的花、叶和 果实中,有多种生物学活性及很高的药用价值,具用生物系统贸易(上海)有限公司,美国)有抗癌、抗炎、抗菌、抗病毒、免疫调节、抗氧化及清1.2实验方法除自由基等作用(刘爽等,2007;Sattuetal.,2007;Waietal.,2008;陈红君等,2014)。在哺乳动物中,1.2.1槲皮素抗氧化活性分析-DPPH法槲皮素对酒精性、缺血再灌注及氧化应激所引起的1,1-二苯基-2-苦基苯肼基自由基(1,6-Bis(di-肝损伤均有一定的疗效(刘爽等,2009;苏俊锋等,phenylphosphino)hexane,DPPH)常用作检测清除自2003;王超等,2012)。目前关于槲皮素对水产动物由基活性的药理模型(Mensoretal.,2001)。DPPH肝胆疾病方面的研究还鲜有报道,本实验用四氯化在519nm波长处有最大吸光值且呈紫红色,当碳(CCl4)对建鲤原代培养肝细胞进行损伤,并通过DPPH自由基被清除时,其最大吸收波长处的吸光度检测细胞色素酶P450(cytochromeenzymesP450,A值随之减小。将DPPH溶于乙醇后,超声振荡混匀,CYP450)及核转录因子-B(nucleartranscription使其在519nm处的吸光值在1.2~1.3。取2mLfactors-,NF-B)的表达和一些生化指标的变化来DPPH溶液加入1mL乙醇,充分混匀后,测A值,记探讨槲皮素对鱼类肝脏疾病的保护作用,为水产保为A0(A0值为0.7~0.9)。取2mLDPPH溶液加入xL肝药物的筛选提供依据。槲皮素溶液,再加(1000-x)L乙醇,混合后静置30min,测A值,记为A。自由基清除能力与吸光度的变1材料与方法化成正相关关系,DPPH的抑制率越高,则清除自由1.1基能力越强,抑制率=(A0-A)/A0100%。实验材料1.2.2肝细胞分离与培养1.1.1实验供试鱼无菌环境中,解剖健康建鲤,取其肝脏置于预

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