尤瑞克林对缺血再灌注大鼠脑神经生长因子表达的影响

作者:李国前;王杰华;杨小霞;潘莹;陈淑增;许秀秀 刊名:中风与神经疾病杂志 上传者:甄鹰

【摘要】目的探讨尤瑞克林对缺血再灌注损伤大鼠脑内神经生长因子(nerve growth factor,NGF)表达的影响及其作用机制。方法线栓法制作大鼠大脑中动脉脑缺血再灌注模型,SD大鼠随机分为假手术组(sham组)、模型组(model组)和实验组(test组)。在缺血2 h再灌注48 h后取材,检测各组大鼠大脑皮质NGF的表达情况。结果与假手术组比较,模型组大脑皮质NGF的表达明显增高(P<0.05);与模型组比较,实验组大脑皮质NGF的表达明显增高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论尤瑞克林可增加缺血再灌注大脑皮质NGF的表达,从而起到脑保护作用。

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神经生长因子(nervegrowthfactor,NGF)是一种具有神经元营养和促突起生长双重生物学功能的神经细胞生长调节因子,对中枢神经系统的再生和修复有着重要的作用[1,2],探索NGF的表达机制对于治疗神经损伤具有重要意义。尤瑞克林是近年研制的国家一类新药,对急性脑血管病具有显著的治疗作用[3],目前作用机制未完全明确。本实验探讨尤瑞克林对大鼠脑缺血再灌注损伤后大脑皮质NGF表达的影响。1材料和方法1.1材料成年雄性SD大鼠24只,体重250~300g,福建医科大学实验动物中心提供。注射用尤瑞克林(0.15PNA单位/瓶),广东天普生化医药股份有限公司;Trizol试剂,美国Invitrogen公司;逆转录试剂盒及PCR试剂盒,加拿大MBIFermentas公司;兔抗大鼠NGF抗体,武汉博士德生物工程有限公司;即用型免疫组化试剂盒(鼠/兔),福州迈新生物技术开发有限公司;-actin和辣根酶标记IgG,北京中杉金桥生物技术有限公司;BeyoECL,West-ern荧光检测试剂,中国碧云天生物技术公司。1.2动物分组与给药实验大鼠随机分为3组:假手术组(sham组)、模型组(model组)和实验组(test组),每组8只。实验组于再灌注后5min静脉注射用灭菌生理氯化钠溶液稀释的尤瑞克林3.510-3PNAU/kg,给药体积1ml/kg。假手术组和模型组正常喂养。1.3模型制备模型组和实验组参考改良Zea-Longa线栓法[4]制备大鼠大脑中动脉栓塞模型。血流阻断2h后拔出线栓,形成再灌注。假手术组大鼠接受相似手术处理,但是不插入线栓。再灌注48h后处死动物断头取脑,取右侧大脑半球视交叉后6~11mm的缺血侧脑组织皮质区备用。1.4半定量PCR法检测NGFmRNA的表达NGF上游引物为:5’-tccacccacccagtcttcca-3’,下游引物为:5’-gccttcctgctgagcacaca-3’(扩增产物344bp);-actin上游引物为:5’-attgtaaccaactgggacg-3’,下游引物为:5’-tctccagggaggaagagg-3’(扩增产物490bp)。取缺血侧脑组织按Trizol法提取总RNA并进行逆转录反应。PCR扩增反应条件为:变性9430s,退火6430s,延伸7230s,反应循环数为34。反应完毕后扩增产物进行电泳,半定量分析电泳条带的吸光度,结果以目的基因与-actin吸光度的比值表示。1.5免疫组织化学法检测NGF的表达大鼠脑组织切片经脱腊至水,室温孵育5~10min,高压修复2~5min;加入一抗兔抗大鼠NGF抗体(工作浓度约为1100),4湿盒孵育过夜;再加入滴加生物素化小鼠抗兔的二抗,室温30min,AEC显色10~20min(显微镜下控制显色程度);自来水充分冲洗,终止反应,苏木素复染;滴加水性封片剂,干燥后中性树胶封片。各步骤间用0.01mol/LPBS冲洗。阳性细胞计数:在400倍光学显微镜下分别随机选取5个视野,分别计数免疫反应阳性的细胞数。1.6Westernblot法检测NGF蛋白的表达取缺血侧脑组织100mg置于玻璃匀浆器中,加入裂解液,严格按照说明书进行蛋白提取,然后采用BCA法测定蛋白浓度。取25g蛋白,变性后垂直电泳,电转至PVDF膜,用含10%脱脂奶粉的TBS室温封闭2h,分别加入一抗(兔抗大鼠NGF抗体,11000;兔抗大鼠-actin抗体,11000),4孵育过夜,用含0.1%Tween-20的TBS洗涤3次,然后与辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(12000)室温孵

参考文献

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