腺苷预处理对大鼠脑缺血再灌注损伤后HIF-1α表达的影响

作者:尉娜;王建平;申小龙;谭军 刊名:中风与神经疾病杂志 上传者:冯照峰

【摘要】目的探讨腺苷预处理对脑缺血再灌注损伤后缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)表达的影响。方法制作大鼠脑缺血再灌注损伤模型。60只SD大鼠随机分为3组:假手术组(F组)、缺血再灌注组(IR组)、腺苷预处理组(AP组),再按缺血再灌注后不同时间把各组随机分成4个亚组(每亚组5只大鼠)。通过免疫组化法检测各组大鼠脑组织HIF-1α的表达。结果 F组可见少量HIF-1α阳性表达,IR组和AP组在脑缺血再灌注后2h开始出现HIF-1α阳性表达的细胞数量增多,24h达到高峰,72h下降,AP组在6h、24h AP组HIF-1α阳性表达比IR组增强(P均<0.05),在72h时AP组HIF-1α阳性表达较IR组减少(P<0.05)。结论腺苷预处理能够进一步增强大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后HIF-1α的表达;HIF-1α的表达上调可能是腺苷预处理诱导脑缺血耐受的分子机制之一。

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脑血管疾病是人类三大死亡原因之一,尤其多发于老年患者,而脑缺血再灌注脑损伤(ischemia-reperfusion,IR)是其中的一种,具有不可预知性、致残率高及预后差等特点,严重影响了老年人的生活质量。缺血耐受是迄今已知的内源性保护机制,是机体抵抗缺血再灌注损伤的一种有效方法,也为防止脑缺血再灌注损伤开拓了新的研究领域。本实验建立大鼠脑缺血再灌注损伤模型,应用腺苷预处理治疗后,观察脑损伤组织病理改变情况及HIF-1在缺血再灌注不同时间点的表达。1材料和方法1.1实验动物及及分组健康SD大鼠60只(雄性,体重250~300克)由新乡医学院实验动物中心提供。60只SD大鼠被随机分为假手术组(F组)、缺血再灌注组(IR组)、腺苷预处理组(AP组)共3组,3组根据再灌注时间随机分为4个亚组2h、6h、24h、72h组,每亚组5只。F组和IR组大鼠于手术前3d开始腹腔注射生理盐水,每天一次,每次2ml;AP组大鼠于手术前2d开始腹腔注射腺苷注射液,剂量为1.5mg/kg,生理盐水稀释到2ml,每天一次。1.2主要试剂腺苷注射液(沈阳光大制药有限公司,批准文号为国药准字H20030320,规格为6mg/2ml);HIF-1多克隆抗体、即用型SABC免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司),NikonMODELYS100显微镜(Ni-kon),照相显微镜HPIAS-2000显微图像定量分析系统(郑州太阳电子科技公司)。1.3实验方法1.3.1大鼠局灶性脑缺血再灌注模型的建立本实验采用尼龙线栓塞法制备大鼠大脑中动脉阻塞(middlecerebralarteryocclusion,MCAO)模型[1,2],并加以改良。将SD大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液(3ml/kg)麻醉成功后,在颈正中线处纵向切开皮肤,分离右侧颈总动脉(commoncarotidarter-y,CCA),向近端分离出颈外动脉(externalcarotidartery,ECA)和颈内动脉(internalcarotidartery,ICA)。结扎并离断ECA。ICA分离至颅底,将其分支结扎离断,仅保留ICA入颅的主干通畅。用动脉夹暂时夹闭ICA和CCA,在ECA残端剪一小口,插入准备好的尼龙线,到达大脑中动脉(middlecere-bralartery,MCA)的起始部,插入使其到达大脑前动脉(anteriorcerebralartery,ACA),进入深度约18mm,阻断MCA血流。在ECA残端插线处打结固定尼龙线,打开动脉夹,将尼龙线尾端用黑色记号笔涂黑后留于皮肤外1cm,消毒并逐层缝合。阻断MCA2h后,轻轻向外抽拉尼龙线至ECA主干,使大脑动脉Willis环和MCA恢复血供,保持体温至清醒。大鼠术后单笼饲养,自由饮水和进食,并给予抗生素及补液治疗。1.3.2HIF-1免疫组化染色方法各组大鼠按照时间点取出大脑至培养皿中,切取视交叉前后各2mm厚的脑组织,固定、脱水透明,石蜡包埋切片,用于HIF-1免疫组化检测。按照HIF-1免疫组织化学染色试剂盒说明书进行,光镜观察并应用HPIAS-2000显微图像处理系统采集图片,每张切片随机取8~10个视野,计数HIF-1阳性细胞数,求其平均值为该张切片HIF-1阳性细胞数。1.4统计学方法分析使用SPSS13.0统计软件进行统计学分析,结果用均数标准差(s)表示,数值变量资料的分析采用单因素方差分析(one-wayANOVA),组间两两比较采用最小显著差(LSD)t检验,检验水平=0.05,P<0.05表示有统计学差异。

参考文献

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