γ谷氨酰环化转移酶对斑马鱼早期发育的影响

作者:段小海;宋焱龙;胡炜 刊名:水生生物学报 上传者:孙海棠

【摘要】γ谷氨酰环化转移酶(γ-Glutamyl cyclotransferase,GGCT)是谷胱甘肽循环过程中催化L-γ-GlutamylL-amino acid分解为L-amino acid和5-oxoprodline的关键酶,在防止细胞氧化性损伤中发挥重要作用。研究以斑马鱼为模型,利用吗啡啉(Morpholino,MO)敲降GGCT,发现早期胚胎发育出现脑部发育缓慢、尾短弯曲和环心室水肿等异常表型,原位杂交检测发现脑发育相关标记基因shha、wnt8b与fgf8的表达发生改变。体外转录ggct-m RNA与GGCT-MO共注射,畸形率降低,部分脑部标记基因表达回复正常。此外,使用化学阻断剂阻断GGCT上游的γ谷氨酰转肽酶(γ-Glutamyl transpeptidase,GGT)和下游的5羟脯氨酸酶,斑马鱼胚胎产生发育停滞和水肿表型。敲降GGCT和阻断GGT都降低了胚胎的谷胱甘肽(Glutathione,GSH)的含量,研究表明γ谷氨酰环化转移酶可能通过谷胱甘肽循环在斑马鱼早期胚胎发育过程发挥重要作用。

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谷胱甘肽(GSH)是细胞内最重要的抗氧化和抵抗自由基的物质,与许多生理生化反应密切相关,比如细胞信号的转导,外源物的代谢和硫醇二硫化转换作用等。谷胱甘肽不仅保护细胞膜免受超氧化合物的攻击,同时维持含硫醇基团蛋白质的还原性,以维持它们正确的生物学功能,当细胞不能保持谷胱甘肽正常含量时其生物学功能会遭受不可逆的破坏[1]。细胞还原性的维持对于细胞凋亡、细胞分化、细胞凋亡、基因表达以及表观遗传修饰都具有重要意义。胚胎发育过程中涉及一系列高度控制的细胞增殖和分化过程,却对各种内源和外源氧化性物质很敏感。许多的研究都证实,GSH的浓度、GSH在细胞核的定位与细胞周期的调控、细胞分化密切相关[2]。最新的研究显示GSH很有可能是一种新的内分泌因子[3]。生物体内通过谷胱甘肽循环合成和分解谷胱甘肽,参与谷胱甘肽循环的共有6个酶,其中参与谷胱甘肽合成的酶有5羟脯氨酸酶、谷氨酰半胱氨酸合成酶、谷胱甘肽合成酶和转肽酶,参与谷胱甘肽分解的酶有谷氨酰环化转移酶(GGCT)和谷氨酰转移酶(GGT)。GGCT最早于1972年在大鼠的组织匀浆中发现[4],近年来发现GGCT在很多癌组织中有异常高表达,被认为是一种癌症标记因子[5]。最近的研究表明,与胞浆中的GGCT比较,在人类尿路上皮细胞,附睾滋养层细胞,肺泡型上皮细胞和黏液细胞的细胞核中的GGCT,分子量较小,可能由选择性剪切或翻译后加工形成,作者据此认为定位于细胞核中的GGCT的功能值得深入研究[6]。本实验室发现,性腺败育的转反义sGnRH转基因鲤(Cyprinuscarpio)中,脑部GGCT的表达水平比对照鲤明显升高[7]。GGT位于谷胱甘肽循环过程中GGCT的上游,与GGCT共同参与GSH分解代谢。GGT突变型小鼠表现出严重的生殖发育异常,研究结果证实GGT对维持小鼠的生殖发育系统中半胱氨酸的正常水平具有非常重要的意义[8]。以上结果均提示GGCT可能除了作为癌症标记因子外,还具有不为人所知的重要生物学功能。本研究采用MO技术在斑马鱼早期胚胎中抑制GGCT的表达,同时通过化学阻断剂阻断谷胱甘肽循环中GGCT上游的谷氨酰转肽酶(GGT)和下游的5羟脯氨酸酶,探索了GGCT在斑马鱼早期胚胎发育中的功能。在人类的相关研究中发现,谷氨酰胺循环过程中的酶缺陷,会造成智力低下学习障碍等缺陷[9]。据统计有10%30%的谷胱甘肽合成酶缺陷患儿在新生儿期内死亡,存活下来的一般患有严重的智力发育迟钝[10]。斑马鱼具有体外发育、胚胎透明等特点,本研究将为建立斑马鱼相关疾病模型,研究和治疗GSH代谢异常引起的相关疾病提供新的思路和参考。1材料与方法1.1实验材料实验用AB系斑马鱼来自本实验室,按斑马鱼手册养殖规范饲养[11]。鱼房恒温28.5,光照和熄灯的时间为12h12h。用于全胚胎原位杂交的斑马鱼胚胎经过脱膜处理,在受精10h后使用0.3mmol/L的1-苯基-2-硫脲(1-phenyl-2-thiourea)抑制黑色素形成。1.2MO、mRNA和化学阻断剂的显微注射在本研究中使用的GGCT-MO及其5-miss-match对照均购自GeneTools公司,GGCT-MO设计为针对ggct基因ATG区阻断该基因的翻译过程,其序列为5-AGCTGAGGATCATCCAGGAGCTCAT-3,5-miss-matchMO的序列为5-AGCTCACGATCATGCAGCACCTCAT-3。谷氨酰转肽酶(GGT)化学阻断剂异恶唑醋酸(Acivicin)购于LKTLaboratories公司[12],5羟脯氨酸酶(5-oxoprolina

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