NYGGF4基因表达沉默对3T3-L1脂肪细胞线粒体代谢的影响

作者:史春梅;季晨博;张春梅;朱金改;陈玲;郭锡熔 刊名:实用儿科临床杂志 上传者:李英武

【摘要】目的探讨NYGGF4(又称PID1)基因沉默对脂肪细胞线粒体代谢的影响。方法以3T3-L1前体脂肪细胞为研究对象,体外培养稳定转染NYGGF4基因沉默载体(pGPU6/GFP/Neo-shRNA,NYGGF4-RNAi)的3T3-L1前体脂肪细胞,以转染空载体(pG-PU6/GFP/Neo-shRNA,NC shRNA)的3T3-L1前体脂肪细胞作为对照,经1-甲基-3异丁基黄嘌呤加地塞米松、胰岛素方案诱导分化为成熟脂肪细胞,采用实时定量RCR技术检测成熟脂肪细胞中线粒体代谢酶指标:己糖激酶、乙酰辅酶A羧化酶柠檬酸合成酶、肉毒碱棕榈酰转移酶1、细胞色素C基因表达水平。结果 NYGGF4表达沉默与NYGGF4基因过表达相比,可以部分逆转3T3-L1脂肪细胞中己糖激酶、乙酰辅酶A羧化酶、柠檬酸合成酶、肉毒碱棕榈酰转移酶1、细胞色素C基因表达水平,差异均有统计学意义。结论NYGGF4基因过表达,下调3T3-L1脂肪细胞中定位于线粒体的代谢关键酶,提示NYGGF4基因的动态平衡对维持3T3-L1脂肪细胞的线粒体代谢具有重要作用。

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2010年,WHO预测肥胖流行具有“全球肥胖化”趋势,儿童和青少年肥胖流行也不容乐观[1]。儿童肥胖的发病机制是近年来研究的热点[2-3],遗传因素占肥胖病因的40%以上[4]。NYGGF4(又称PID1)是本研究小组前期以抑制性差减杂交(SSH)技术,在儿童肥胖与健康人腹膜后脂肪组织中发现的差异表达基因[5],且可以通过抑制磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K-PKB)信号通路导致成熟脂肪细胞胰岛素刺激下葡萄糖摄取降低[6]。前期研究还发现NYGGF4基因沉默可增加3T3-L1脂肪细胞基础葡萄糖摄取率、激活PI3K激酶的活性,在胰岛素刺激状态下促进脂肪细胞对葡萄糖的摄取;影响成熟脂肪细胞线粒体基本特性及导致线粒体功能障碍[7]。本研究通过检测NYGGF4基因沉默成熟脂肪细胞中线粒体代谢酶己糖激酶(HKI)、乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、柠檬酸合成酶(CS)、肉毒碱棕榈酰转移酶1(CPT1)、细胞色素C(Cyc-c)基因表达水平,探讨NYGGF4基因表达沉默对成熟脂肪细胞线粒体代谢的影响。1材料与方法1.1材料稳定转染NYGGF4基因表达沉默的3T3-L1前体脂肪细胞株(pGPU6/GFP/Neo-shRNA,NYGGF4沉默组)及空载对照细胞株(pGPU6/GFP/Neo-shRNA,NCshRNA,对照组)由本实验组张春梅构建[7];稳定转染NYGGF4基因的3T3-L1前体脂肪(NYGGF4过表达组)细胞株由本实验组朱冠忠构建[8];改良Eagle培养基(DMEM)购自美国GIBCO公司、胎牛血清(FBS)购自加拿大Wisent公司;地塞米松(DEX)、1-甲基-3-异丁基黄嘌呤(MIX)、胰岛素、油红O染料购自美国Sigma公司;PCR引物及探针购自瑞士罗氏公司;RNA抽提试剂盒购自德国Qiagene公司;反转录试剂盒购自瑞士罗氏公司;Tan-MangeneexpressionmasterMix购自美国ABI公司。1.2方法1.2.1细胞培养及诱导分化将3T3-L1前体脂肪细胞接种于6孔板中,待细胞融合度达100%后2d(d0),采用DEX、MIX、胰岛素联合方案开始诱导分化,将培养液换成含0.5mmolL-13-异丁基-1-甲基黄嘌呤(MIX)、1molL-1DEX、100nmolL-1胰岛素的完全培养液。48h后撤去DEX、MDI,使培养基中仅含有100nmolL-1胰岛素。每2d换液1次,至第8天,经油红O染色鉴定,80%以上细胞分化为成熟脂肪细胞。1.2.2线粒体代谢酶的检测结合酚/氯仿(Trizol)法和QiageneRNA抽提试剂盒抽提细胞总RNA,10gL-1琼脂糖凝胶电泳显示RNA的28S、18S2条带清晰可见,应用美国ThermoScientific公司的Nanodrop2.0检测RNA浓度及A260/A280比值为1.82.0,RNA(500ng)经反转录反应后采用TanMan探针法检测成熟脂肪细胞中线粒体代谢酶HKI、ACC、CS、CPT1、Cyc-c基因表达水平。采用CT法计算HKI、ACC、CS、CPT1、Cyc-c基因的相对表达量:目的基因相对表达量=2CT(参考基因)-CT(目的基因)。HKI、ACC、CS、CPT1、Cyc-c及参考基因引物序列及探针号见表1。表1基因引物序列及探针号基因上游引物(5'-3')下游引物(5'-3')探针号HKITGTGGGTCACGATGTAGCCCCACATCCAGGTCAAATTCC#89ACCGCGTCGGGTAGATCCAGTTCTCAGTGGGGCTTAGCTC

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