脂多糖致HUVEC细胞凋亡和线粒体跨膜电位损伤影响

作者:唐晶;李华;孙玉红;章卓 刊名:四川生理科学杂志 上传者:尹龙

【摘要】目的:探讨不同浓度脂多糖致HUVEC细胞凋亡和线粒体跨膜电位损伤相关性。方法:体外培养人脐静脉血管内皮细胞株(HUVEC),先将脂多糖(LPS)分为100、10、1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5μg·ml-18个浓度,刺激0.5、1、2、6、12、24h后用CCK-8法观察细胞增殖影响进行初筛,之后选择脂多糖(LPS)分为100、10、1、10-1、10-2μg·ml-15个浓度刺激HUVEC细胞株12h,Annexin-V/FITC双染后流式细胞仪检测细胞凋亡率,荧光显微镜观察Hochest33342/PI双染后细胞形态,罗丹明染色后荧光显微镜检测细胞线粒体跨膜电位变化。结果:同阴性对照组比较,LPS浓度≥10-2μg·ml-1刺激12、24h均可引起细胞活力明显下降(P<0.05),其余浓度引起HUVEC细胞活力下降时间不等。LPS致细胞凋亡率随浓度增加而增加,分别为67.2%、43.5%、23.5%、17.3%、10.6%,呈剂量依赖性;Hochest33342/PI双染显示10-1μg·ml-1以上浓度组HUVEC即出现核浓缩和凋亡小体,甚至有少量死亡细胞;10-1μg·ml-1以上浓度组细胞荧光较强,线粒体跨膜电位降低。结论:10-1μg·ml-1以上浓度LPS刺激12h可致HUVEC细胞凋亡,线粒体跨膜电位下降;LPS10-1μg·ml-1刺激HUVEC 12h即可致理想的细胞凋亡模型。

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阿尔茨海默病(Alzheimerdisease,AD)是一种常见的老年病,目前全球患者达2000万,AD属于慢性进行性神经变性疾病,具有认知功能和记忆损害、神经心理症状和精神行为异常等主要特征,目前尚无有效手段治疗[1]。血管内皮细胞衬覆于血管内壁,构成血管通透性的主要屏障,有调节细胞代谢产物、调节血管舒张、止血和趋化白细胞的作用[2]。血管内皮细胞生长、凋亡和生存的协调状态,保证正常血管功能和结构,炎症与血管内皮细胞凋亡在阿尔茨海默病发病机制中占重要地位。脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)为革兰氏阴性菌细胞壁的组分,可以引发炎症,激活多种细胞因子损伤血管内皮细胞[3],因此深入了解LPS与血管内皮细胞凋亡发生发展的规律,对寻找保护血管内皮措施有重要意义。目前对脂多糖引起HUVEC凋亡和线粒体损伤间关系研究较少,故本研究通过采用不同浓度的LPS在不同时间诱导HUVEC细胞凋亡,分析其凋亡和线粒体跨膜电位改变间关系,确定LPS诱导HUVEC细胞凋亡的最佳细胞凋亡模型,为进一步阐明阿尔茨海默病的分子机制提供科学依据。1材料与方法1.1材料LPS(Sigma,L2880);HUVEC细胞(泸州医学院功能性食品与药品研究中心惠赠);AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒(Keygen公司,批号20140207);Hoechst33342以及PI(Sigma,USA);CCK-8试剂盒(碧云天生物技术研究所);RPMI1640培养基,胎牛血清(Hyclone,USA)。1.2仪器倒置相差显微镜(日本Olympus公司,CKX41型);CO2培养箱(日本Sanyo公司,MCO-15AC型);超净工作台(苏州净化设备有限公司,SW-CJ-1F型);离心机(北京医用离心机厂,LG10-3A型);酶标分析仪(北京普朗新技术有限公司,DNM-9602型);激光共聚焦扫描显微镜(德国LEICA公司,TCSSP5型)。流式细胞仪(美国BD公司,SBK-YLQX-003552型)。1.3实验器材去热源处理为了排除实验中可能存在的内毒素污染,我们严格遵循无热原原则,实验用移液管、离心管、吸管等玻璃器材均经250高温1.5h-3h去热原处理;培养板、其他塑料器材均辐照去热原,使用超纯水代替双蒸水配制细胞培养液。1.4CCK-8法检测HUVEC细胞活性将LPS溶于超净水,配成10mgml-1母液分装,-20冻存备用。HUVEC细胞株培养液为RPMI1640+10%胎牛血清+青链霉素,5%CO237培养箱中培养。每3~4d传代1次。倒置显微镜观察细胞生长情况。分组:1阴性组:不加任何处理因素。2实验组:LPS分为100、10、1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5gml-18个浓度,每个浓度组的刺激时间为0.5、1、2、6、12、24h。取对数生长期的HUVEC细胞,0.25%胰酶制成单个细胞悬液,细胞浓度为1105L-1接种于96孔板,每孔90l,培养24h待其贴壁后加药。每个浓度3个复孔,LPS组(LPS+细胞)100、10、1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5gml-1,阴性组(细胞+培养基)加等体积RPMI1640培养基,空白组仅有培养基无细胞,培养时间为0.5、1、2、6、12、24h,之后每孔加入CCK-810l继续培养1h,酶标仪450nm波长下检测各孔吸光度值,以OD值反应细胞活力情况,连续重复3次。1.5Hochest33342/PI双染检测HUVEC细胞凋亡HUVEC细胞培养同1.2.1,根据1.4结果

参考文献

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