胃癌组织中细胞周期素D1的表达与细胞周期的关系

作者:周梅芳;王立平;林彬 刊名:江苏医药 上传者:刘吉元

【摘要】目的研究胃癌组织中细胞周期素D1(cyclin D1)的表达,并分析其与细胞周期的关系。方法采用Western blot和流式细胞术检测33例胃癌组织及其相应正常胃黏膜周期素D1表达和细胞周期分布。结果胃癌组织周期素D1阳性率63.6%,高于正常胃黏膜的21.1%(P<0.01)。周期素D1阳性组胃癌G1/G0期细胞比例为(42.2±1.5)%,显著低于周期素D1阴性组的(64.3±4.8)%(P<0.01);周期素D1阳性组胃癌S期细胞比例为(55.1±1.8)%,显著高于周期素D1阴性组的(34.5±4.9)%(P<0.01)。结论胃癌细胞高表达细胞周期素D1预示癌细胞具有高增殖活性。周期素D1在胃癌发生、发展过程中可能起着重要的作用。

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细胞周期的调控依赖于周期素依赖性激酶抑制剂(CKI)的相互作用,其中细胞周期蛋白周期素D1是主要的调节因子。近年研究发现,细胞周期失控是导致细胞增殖癌变的重要原因,周期素D1通过与CDK4和CDK6结合,激活其激酶活性,发挥细胞周期调节功能[1,2]。同时,这些激酶又依赖于CKI的反向调节[3]。周期素D1是细胞受到刺激后进入细胞周期而表达的第一组细胞周期素,在细胞G1期进程中作为调节亚基控制着G1期的速度。已发现在人类多种恶性肿瘤中,如肺癌、胃癌、卵巢癌、肝癌、食管癌、乳腺癌、大肠癌等常出现周期素D1异常高表达,因此被认为是癌基因,与肿瘤的浸润转移、临床分期与预后密切相关[4-9]。本实验采用Westernblot和流式细胞术方法,对33例胃癌组织周期素D1的表达进行研究,以探讨周期素D1与胃癌细胞周期的关系。资料与方法一、一般资料33例胃癌组织取自临床手术切除的新鲜标本,男18例,女15例,年龄42-71岁,中位年龄56岁。术后经病理确诊,其中乳头状腺癌12例,管状腺癌7例,低分化腺癌14例。同时取癌旁胃黏膜作为对照。二、方法1.标本处理取新鲜胃癌标本,迅速用眼科剪剪碎,立即置于冰磷酸盐缓冲液(PBS)中,0.1%的胃蛋白酶溶液(0.1mmol/L的HCl配制)30-50ml,37环境中孵育约2h,收集消化下来的含细胞的絮状黏液,用PBS洗,以筛网(200目)过滤后,离心(1200r/min,10min)。分为A、B两管,A管细胞-80反复冻融,收集蛋白,备做Westernblot;B管细胞用80%冰乙醇固定,-20过夜,备做流式细胞术检测。2.免疫印迹配制10%聚丙烯酰胺凝胶溶液,70V恒压电泳,分离蛋白质;用3V,90mA条件,用电转移仪(ContinentalLabProducts,Inc.)将蛋白质转移到PROTRAN?NitrocelluloseTransferMembrane(Schleicher&SchuellInc.);封闭液(0.5%FBS,50mmol/LTris-HClpH7.5,150mmol/LNaCl,0.1%Tween-20,0.02%NaN3)封闭1h,1TBST(50mmol/LTris-HClpH7.5,150mmol/LNaCl,0.1%Tween-20)洗膜3次,每次5min;4条件下与第一抗体(鼠抗人周期素D1抗体,福州迈新生物技术公司,工作浓度11000)孵育过夜,1TBST洗膜3次,每次5min;室温条件下与第二抗体辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体(CellSignalingTechnology,Inc.)反应1h,1TBST洗膜3次,每次5min;加入LumiGLO化学发光显色液(CellSignalingTechnology,Inc.),曝光X线胶片。3.流式细胞术将冰乙醇固定后的细胞加入10mg/L碘化丙啶和0.1%RNaseA(Sigma公司)进行DNA避光染色20min,经荧光标记后的细胞用FACsort流式细胞仪(美国BectonDickinson公司)进行检测,结果用CellQuest软件处理分析。三、统计与处理采用SPSS13.0软件包,计量数据以均数标准差(x珚s)表示,两两比较采用配对资料卡方检验,多组之间比较用ANOVA进行,P<0.05为差异有统计学意义。结果一、免疫印迹检测33例胃癌组织标本周期素D1表达阳性21例,总阳性率为63.6%,而胃黏膜阳性率仅为21.2%(7/33)(图1)。周期素D1表达与胃癌临床生物学特性的关系见表1。二、流式细胞术检测流式细胞术检测胃

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