大鼠局灶性脑缺血预处理后XBP-1表达的变化

作者:胡跃强;唐农;刘泰;祝美珍;覃琴;苏锦勋 刊名:中风与神经疾病杂志 上传者:陈润勋

【摘要】目的观察缺血预处理对大鼠脑缺血再灌注后X盒结合蛋白1(XBP-1)mRNA及其蛋白表达的影响。方法 SD大鼠60只,随机分为假手术组(SO)、脑缺血再灌注组(MCAO)、脑缺血预处理组(BIP)3组,每组按照再缺血后12h、1d、2d、3d 4个时间点分为4个亚组。采用二次线栓法制备大鼠局灶性脑缺血预处理模型,用实时荧光定量PCR和Western blot法观察再缺血后各个时间点XBP-1 mRNA及其蛋白的表达变化。结果 MCAO组XBP-1 mRNA及其蛋白表达均于缺血再灌注后12h开始明显上升,24h达高峰(P<0.01),随再灌注时间延长其表达逐渐下降,但仍保持较高表达水平(P<0.01);BIP组较MCAO组XBP-1 mRNA及其蛋白表达明显升高(P<0.05,P<0.01)。结论脑缺血预处理可能通过诱导XBP-1表达发挥其神经保护作用。

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脑缺血预处理(brainischemicpreconditioning,BIP)又称为脑缺血耐受(ischemictolerance,IT),是近年发现的重要内源性神经保护机制。最近有研究发现内质网应激(endoplasmicreticulumstress,ERS)在此环节中发挥了关键作用,其中X盒结合蛋白1(X-boxbindingprotein1,XBP-1)作为评价ERS的指标是内质网应激细胞保护信号途径中的关键分子[1],在抗凋亡途径中起重要的保护作用[2]。本实验通过建立大鼠局灶性脑缺血预处理模型,通过检测BIP后XBP-1mRNA及蛋白在脑内的表达变化,以进一步研究BIP的神经保护机制,从而为临床治疗缺血性脑血管病提供理论依据。1材料与方法1.1动物分组及处理健康雄性SD大鼠60只,体重25050g,随机将大鼠分为3组:假手术组(SO);大脑中动脉缺血组(MCAO):假手术+脑缺血组(SO+MCAO);BIP组:预缺血+脑缺血组(BIP+MCAO)。每组按照再灌注后12h、1d、2d、3d4个时间点平均分为4个亚组(n=5)。分别作如下处理:SO组:以假手术代替预缺血及缺血再灌注;MCAO组:以假手术代替预缺血,其余步骤同BIP组;BIP组:MCAO10min后抽出栓线,完成预缺血,3d后再次行MCAO2h,再灌注后12h、1d、2d、3d处死大鼠。1.2动物模型的制备参照Longa的线栓法进行造模。采用大脑中动脉二次线栓法[3]制备大鼠脑缺血预处理模型,结扎大鼠左颈外动脉远端和颈总动脉近端,将前端用火焰烧圆的尼龙线从颈总动脉残端插入,进线约1820mm,MCAO后10min抽出线栓,完成预缺血。3d后再次行MCAO2h,规定时间点处死动物取脑。1.3主要试剂兔抗大鼠XBP-1多克隆抗体,美国SantaCruz公司;偶联有辣根过氧化物(HRP)羊抗兔IgG二抗,博士德公司;内参GAPDH,康成生物公司。总RNA提取试剂盒(TIANGEN公司);PCR反应试剂盒及逆转录试剂盒(TaKaRa公司);引物及内参均由大连宝生物有限公司提供。1.4缺血半暗带脑皮质XBP-1mRNA表达测定(1)大脑组织总RNA提取:参考Trizol试剂盒说明书提取总mRNA。(2)引物合成:荧光定量RT-PCR所用的XBP-1和GAPDH引物序列如下:XBP-1,上游5’-GGATGAATGCCCTGGTTACTGA-3’;下游5’-CAGAGGCGCACGTAGTCTGA-3’,产物长度113bp;GAPDH,上游5’-GACAACTTTGGCATCGTG-GA-3’下游5’-ATGCAGGGATGATGTTCTGG-3’,产物长度133bp。(3)比较两基因扩增效率:选取cD-NA样品模板进行5倍梯度稀释,XBP-1与GAPDH分别进行real-timePCR反应,得出荧光曲线,基因表达的相对定量基于比较CT(thresholdcycle)值法。(4)反应体系及条件:两种基因同管扩增,反应体系均为10l,其中SYBRPremixExTaq(2)5l,cDNA模板1.0l、两种基因上下游引物(10pmol/l)各0.4l、探针(10pmol/l)各0.4l,加无RNA酶的水至3.2l。在DNAEngineOpticonTM2连续荧光检测系统(MJResearch公司)中进行扩增反应。反应条件为:94预变性30s、955s、60.220s,60.020s,40个循环,4保存。每例样品及阴性对照均设3个平行复孔,取均值。1.5缺血半暗带脑皮质内XBP-1蛋白表达

参考文献

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