紫草LeEXT-1基因的克隆、序列及表达分析

作者:汤程贻;殷晶晶;邹爱兰;戚金亮;杨永华 刊名:南京农业大学学报 上传者:王仲

【摘要】以硬紫草细胞为材料,采用快速扩增cDNA末端法(rapid amplification of cDNA ends,RACE)克隆了由抑制消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)和cDNA芯片技术筛选获得的在黑暗条件下优先表达的LeEXT-1基因的全长cD-NA。生物信息学分析结果表明,该cDNA全长为1 077 bp,编码1个含247个氨基酸的蛋白,与编码伸展蛋白(extensin)的基因具有高度的同源性。基因表达分析结果表明,当紫草细胞从B5培养基转到M9培养基时,LeEXT-1基因在2 h内被快速诱导表达,随后又逐渐降低到一个较低的水平。该基因的克隆为进一步研究伸展蛋白在紫草宁合成调控中的作用奠定了基础。

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紫草科植物是我国珍贵的药用植物,主要包括硬紫草(Lithospermumerythrorhizon)、滇紫草(Onosmapaniculatum)等,其根部富含紫草宁,具有抗菌、消炎和抗肿瘤等多种疗效,在中药产业中具有重要的应用前景[1]。光是自然界中影响植物生长发育的最重要的环境因素之一,在大多数植物培养细胞中,次生代谢产物尤其是酚类化合物的合成是受光诱导的[2],但是在紫草细胞培养体系中,光对紫草宁的形成却呈显著的负调控效应[3]。目前研究结果表明,在所有的理化因子中,光信号是调控紫草宁合成的一个较为复杂的影响因子[3-4]。然而,当前关于受光信号调控的紫草基因依然甚少,因此需要克隆更多的新基因,从而进一步探讨光信号调控紫草宁生物合成的分子机制。本课题组前期构建了不同光信号下紫草细胞的SSH文库,并通过结合cDNA芯片分析得到1个在黑暗条件下大量表达,而在光照条件下表达降低的cDNA片段(编号为A350)。对A350片段的进一步研究发现,该基因可能受到光信号的严格调控。因此,为进一步深入研究该基因的功能,本研究通过RACE法,克隆了A350基因的全长cDNA(LeEXT-1基因),并对其进行了详细的生物信息学分析以及早期表达模式的研究。1材料与方法1.1植物材料与试剂紫草宁高产细胞系Y8由本实验室建立。M-MLV反转录试剂盒购自Promega公司;SmartRace全长试剂盒购自Clontech公司;DNA纯化试剂盒、Taq酶、dNTP、DEPC、异硫氰酸胍及其他分子生物学试剂均购自南京生兴生物技术有限公司;B5与M9培养基配方见参考文献[5];其他化学试剂均购自南京化学试剂有限公司。1.2紫草LeEXT-1基因的3'RACE与5'RACE扩增以M9培养基中黑暗悬浮培养10d的紫草细胞为材料,提取总RNA(采用改进的异硫氰酸胍法[6]),并用Adaptor-oligodT作为引物进行反转录。根据已获得的LeEXT-1基因的A350片段序列,利用上游引物A350-F2(5'-CCTCACCACTACCGTTACAATC-3')、下游引物A350-R2(5'-CTGATCTAGAGGTACCGG-ATCC-3')和连接了Adaptor的cDNA,进行LeEXT-1基因的3'端RACE扩增。按SmartRace全长试剂盒设计特异引物:A350-SMART-157(5'-AATCTTACAGGTGGGTGATGGGG-AGGT-3')和A350-5-RACE-79(5'-GGTGATGGGGAGGTGGAGGAGATTGT-3'),以反转录获得的cDNA为模板,与试剂盒中的引物进行巢式PCR反应,来扩增LeEXT-1基因的5'端。1.3紫草LeEXT-1基因全长cDNA的生物信息学分析紫草LeEXT-1基因序列的ORF由NCBI网站的ORFfinder软件进行查找。紫草LeEXT-1蛋白一级结构由Expasy网站的pI/MW软件进行预测与分析;信号肽由SignalP4.0软件进行预测;跨膜域由TMHMM2.0软件进行预测;二级结构由Scansite2.0软件与PBILLYON-GERLAND数据库进行预测与分析;同源性比较由NCBI网站的BLASTx软件进行分析,多序列对齐分析与系统进化树分析由DNAman数据库进行分析。1.4紫草LeEXT-1基因的早期表达模式分析以在B5培养基光照条件下和立即接种至M9培养基黑暗条件下培养了24h的紫草细胞为材料(取样时间点为0.25、0.5、1、2、4、6、8、12、16、20和24h),提取总RNA,并进行反

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