补阳还五汤对局灶性脑缺血大鼠TLR4表达的影响

作者:周赛男;蔺晓源;郭乐;易健;谭峰;郭纯;刘柏炎;蔡光先;黄献平 刊名:中药新药与临床药理 上传者:郭永平

【摘要】目的探讨补阳还五汤对局灶性脑缺血大鼠脑组织TLR4表达的影响。方法 72只大鼠随机分为假手术组、模型组和补阳还五汤组,每组按给药后7、14、21 d 3个时间点再各分3组,用免疫组化、Western blot、RT-PCR法检测各组不同时间点TLR4的蛋白和基因表达。结果模型组和补阳还五汤组各时间点TLR4蛋白和mRNA表达均高于假手术组(P<0.05),补阳还五汤组在第7、14天TLR4蛋白表达明显低于模型组,但TLR4mRNA水平在第7天、14天却明显高于模型组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论补阳还五汤通过调节缺血后脑组织TLR4的表达可能是其治疗脑缺血的作用机制之一。

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脑缺血后可导致一系列细胞、分子事件,主要包括线粒体能量代谢障碍、离子平衡失调、氧化应激、细胞凋亡、炎症反应、组织修复与再生等,其中炎症反应扮演着重要角色。而Toll样受体4(Toll-likere-ceptor4,TLR4)作为炎症反应信号传导通路的门户蛋白之一,可能成为治疗脑缺血的新靶点[1]。补阳还五汤出自清代王清任的《医林改错》,是治疗缺血性中风及其后遗症的经典名方,该方在临床上应用广泛且疗效确切[2-3],但作用机制尚未明确。本文采用大脑中动脉线栓法复制大鼠局灶性脑缺血模型,探讨补阳还五汤对实验性脑缺血后TLR4表达的影响,以期为治疗缺血性脑中风临床用药提供实验依据。1材料与方法1.1动物健康雄性SD大鼠99只,SPF级,体质量260280g,购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司,动物合格证号:004535。1.2药物补阳还五汤来源于《医林改错》,处方组成:黄芪120g,赤芍4.5g,川芎3g,归尾6g,干地龙3g,红花3g,桃仁3g。药材经湖南省中医药研究院鉴定均符合《中国药典》2005年版标准,补阳还五汤药剂水煎并浓缩至2gL-1,冷藏待用。1.3药品及试剂兔抗大鼠TLR4多克隆抗体,批号:20110319,武汉博士德生物工程有限公司;辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(批号:20110808)、PV-6001免疫组化试剂盒(批号:20100906)、DAB显色试剂盒(批号:20100315),北京中杉金桥生物技术有限公司;DNAMaker,批号:20100206,北京科技有限公司;逆转录试剂盒,批号:20111204,Fermentas公司;PCRmix,批号:20120316,北京天根科技有限公司。1.4主要仪器Finesse325型石蜡切片机,英国Shando公司;Bx51光学显微镜及IPP5.1图像分析系统,日本Olympus公司;GE-100凝胶电泳仪、TC-48/T/H(a)基因扩增仪,杭州大和热磁电子有限公司;UV-1750紫外分光光度计,日本岛津公司;GIS-1000数码凝胶图像分析系统,上海天能科技公司。1.5实验方法1.5.1模型制备及评价采用大脑中动脉线栓法复制大鼠局灶性脑缺血模型[4]。假手术组仅切开皮肤、分离左侧颈总动脉后随即缝合。动物清醒2h后参照Longa[4]及Bederson[5]的5分制法进行神经功能评分,分值在13分者入组。评分越高,神经功能缺损越严重。剔除标准:评分低于1分;蛛网膜下腔出血;HE染色无脑缺血病理改变;未到时间点死亡。因大鼠死亡等致样本量不足时随机替补。1.5.2分组及给药将大鼠随机分为假手术组、模型组和补阳还五汤组,每组24只,每组又按3个时间点分别于首次给药后7、14、21d处死,每个时间点8只。补阳还五汤组于术后2h后开始给药,每天给药剂量为5gkg-1(成人等效剂量),每天灌胃1次。模型组和假手术组均给予等体积蒸馏水。1.5.3免疫组化法检测大鼠脑组织TLR4表达每组每个时间点5只大鼠,10%水合氯醛麻醉后断头取脑,4%多聚甲醛固定。各组组织切片一抗用兔抗大鼠TLR4多克隆抗体(1100),阴性对照用PBS替代,4冰箱孵育过夜,山羊抗兔二抗室温孵育40min,DAB显色。每只动物取切片5张,采用IPP5.1图像分析系统,光镜高倍(400)下记录每张切片5个相同单位面积的阳性细胞数。1.5.4免疫印迹法(Westernblot)法检测大鼠脑组织TLR4表达每组每个时间点3只大鼠,水合氯醛麻醉后冰上断头取左侧海马、顶叶皮质放于液氮灌中备用。操作步骤依次为:蛋白质提取;BCA法测定

参考文献

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