铁缺乏对大鼠FRTL细胞甲状腺过氧化物酶表达的影响

作者:李永梅;白彦东;林来祥;孙毅娜;陈祖培 刊名:中华疾病控制杂志 上传者:叶少娜

【摘要】目的研究铁缺乏对大鼠甲状腺细胞系(fisher rat thyroid cell line,FRTL)甲状腺过氧化物酶表达的影响,并探讨其影响机制。方法体外培养FRTL细胞,用原子吸收火焰法测定F-12完全培养基中的铁含量,根据其完全培养基的铁含量分为4组:正常对照组(0.20μg/ml),轻度铁缺乏组(0.10μg/ml),中度铁缺乏组(0.05μg/ml),重度铁缺乏组(0.00μg/ml),培养48 h后,用实时定量聚合酶链反应和细胞免疫荧光技术对不同铁干预条件下甲状腺过氧化物酶(thyroid peroxidase,TPO)mRNA及蛋白表达进行检测。结果随着培养液中铁含量的降低,FRTL细胞TPO mRNA表达水平逐渐减少,且中、重度铁缺乏组与对照组比较,差异均有统计学意义(均有P<0.05)。铁缺乏组TPO蛋白较对照组表达减少且荧光强度较弱。结论铁缺乏降低甲状腺过氧化物酶的表达可能是导致甲状腺功能低下的一个重要机制。

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甲状腺激素是调节机体新陈代谢、生长发育和脑发育不可缺少的激素。而甲状腺过氧化物酶(thyroidperoxidase,TPO)是甲状腺激素合成不可缺少的关键酶,在甲状腺激素合成中具有重要的作用。近来有一些流行病学研究显示,在一些碘补充充足的地区仍然有地方性甲状腺肿的存在,发现铁缺乏的患者促甲状腺激素(thyroidstimulatinghormone,TSH)明显增高,游离甲状腺素(freethyroxin,FT4)也比血清铁蛋白正常组低。Eftekhari等[1]对伊朗缺铁的青春期女性的研究显示,铁的补充可以改善甲状腺功能,说明铁缺乏影响甲状腺代谢和功能。但至今,铁缺乏影响甲状腺代谢的机制还未完全明确,本实验欲通过体外培养大鼠甲状腺细胞系(fisherratthyroidcellline,FRTL),模拟铁缺乏的状态,观察铁缺乏对FRTL细胞过氧化物酶表达的影响从而探讨影响其机制,对于铁缺乏对甲状腺功能的影响提供理论依据与实验经验,现将研究结果报告如下。1材料与方法1.1细胞、仪器与试剂FRTL细胞购于美国ATCC公司。Real-timePCR仪(Bio-Rad公司,美国),荧光显微镜(Leica,德国),原子吸收分光光度计(Hitachi公司,日本),倒置显微镜(Nikon公司,日本),CO2培养箱(formascientific公司,美国)。新生小牛血清(Hyclone公司,美国),胰酶(Gibico公司),逆转录试剂盒(Fermentas公司,大连),TPO抗体(Santa公司,美国),二抗异硫氰酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate,FITC)(博奥森公司,北京),SYBRPremixExTaq(宝生物公司,大连),铁标准品(天津基准化学公司)。总RNA提取试剂Trizol、焦碳酸二乙酯(diethypyrocarbonate,DEPC)购自Invitrogen公司(美国)。F-12COONSModifica-tion培养基、1640培养基、TSH转铁蛋白、apo-转铁蛋白、氢化可的松,胰岛素,谷氨酰胺,牛血清白蛋白,铁剂(FeSO47H2O)均购自Sigma公司(美国)。1.2细胞培养在F-12培养基中加入5%小牛血清、1mU/mlTSH、10g/ml胰岛素、5g/ml转铁蛋白、5ng/ml氢化可的松、0.3mg/ml谷氨酰胺、5g/ml转铁蛋白,100ml培养液加入1ml青链霉素。其细胞贴壁培养2d后,状态俱佳时,换成无铁无血清的1640完全培养基培养(所用的转铁蛋白apo-转铁蛋白为无铁的转铁蛋白),使其代谢2d后,按照实验分组进行干预48h后,进行测定实验。1.3完全培养基Fe含量的测定梯度稀释铁标准品(0.1mg/ml),配置Fe标准系列:取其浓度分别:50g/ml、10g/ml、2g/ml、1g/ml、0.2g/ml、0.1g/ml。用原子吸收火焰法测定F-12完全培养基[2],测定FRTL细胞所需要含铁量为(0.200.03)g/ml。1.4实验分组F-12完全培养基测定的含铁量0.2g/ml,此培养体系铁含量为FRTL细胞生长适宜浓度,根据其完全培养基的含铁量分为4组:正常对照组(0.20g/ml),轻度铁缺乏组(0.10g/ml),中度铁缺乏组(0.05g/ml),重度铁缺乏组(0.00g/ml),其实验干预的铁剂为FeSO47H2O(560mg/L)。1.5FRTL细胞内甲状腺过氧化物酶mRNA逆转录PCR检测1.5.1细胞内总的RNA的提取将FRTL细胞种于6孔板中,按照实验分组进行干预48h

参考文献

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