槲皮素对肝细胞氧化应激损伤的保护作用

作者:沈钦海;秦召敏;刘丽;岳淑英;吕建华;鲁艳芹 刊名:天津医药 上传者:王大鹏

【摘要】目的探讨槲皮素对氧化应激Chang liver细胞损伤的保护作用及其作用的分子机制。方法培养Chang liver细胞,将细胞随机分为正常对照组、H2O2组及槲皮素低、中、高剂量组。MTT法检测肝细胞的存活率;流式细胞术检测细胞凋亡率。2′,7′-二氯荧光素乙二酯(DCFH-DA)细胞内活性氧(ROS)荧光染色后,荧光显微镜观察照相及流式细胞仪检测细胞内活性氧水平。试剂盒测定细胞中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性及细胞中丙二醛(MDA)的含量。采用Western blot法检测Nrf2蛋白的表达。结果 H2O2组较正常对照组细胞存活率、SOD、GSH-Px、CAT活性降低(P<0.05),凋亡率、平均荧光强度(MFI)及MDA升高(P<0.05)。不同剂量槲皮素组细胞存活率及细胞内SOD、GSH-Px、CAT活性高于H2O2组(P<0.05),MDA、凋亡率、MFI水平低于H2O2组(P<0.05)。槲皮素低、中及高剂量组Nrf2蛋白均高于H2O2组(P<0.05)。结论槲皮素对氧化应激肝细胞损伤具有保护作用,其机制可能与激活Nrf2-ARE通路,进而增强下游抗氧化基因的表达有关。

全文阅读

研究认为,氧化应激与肝脏疾病的发生密切相关[1]。其主要通过启动膜脂质过氧化、改变生物膜功能、与生物大分子共价结合及破坏酶的活性等引起不同程度的肝损伤[2]。转录因子NF-E2相关因子2(Nrf2)及其诱导的下游靶基因是机体细胞最重要的抗氧化防御机制之一[3]。在氧化应激过程中,Nrf2被激活诱导靶基因保护肝脏[4]。槲皮素(quercetin)是一种天然黄酮类化合物,广泛存在于蔬菜、水果和茶叶中[5]。研究证实,槲皮素可通过降低脂质过氧化物水平、增加抗氧化系统的能力,从而对氧化损伤的肝脏发挥保护效应[6];还可通过增加Nrf2的表达,提高细胞的抗氧化能力[7]。本研究利用H2O2在体外诱导Changliver细胞建立肝损伤模型,旨在探讨槲皮素对肝细胞的保护作用及其抗氧化作用的机制。1材料与方法1.1材料Changliver细胞购自中南大学湘雅中心实验室;2,7-二氯荧光素探针(2,7-dichlorofluorescindiacetate,DCFH-DA)、槲皮素、H2O2、四甲基偶氮唑蓝(MTT)及二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma公司;胰蛋白酶及胎牛血清购自美国Hyclone公司;超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)试剂盒均购于南京建成生物工程研究所;Nrf2、-actin抗体均购于美国SantaCruze公司;RPMI-1640细胞培养基、硝酸纤维素膜购于美国Gibco公司。1.2细胞培养及分组Changliver细胞培养于含10%优质胎牛血清RPMI-1640培养液中,加入1105U/L青霉素和100mg/L链霉素,于37、5%CO2中培养,每2~3d用0.25%胰酶消化传代,直至细胞处于对数生长期。细胞随机分为正常对照组、H2O2组、槲皮素低剂量组、槲皮素中剂量组及槲皮素高剂量组。正常对照组仅用无血清培养基培养细胞,不加任何药物处理;H2O2组用无血清培养基预培养24h,换液后加入含400mol/LH2O2的无血清培养基继续培养12h;槲皮素各浓度组分别用含20、40、80mol/L槲皮素的无血清培养基预培养24h。1.3MTT检测细胞活力取对数生长期Changliver细胞,以5104个/孔的浓度接种于96孔板,200L/孔,每组3个复孔,各组处理时间终止时去除培养基,分别加入MTT,终浓度为0.5g/L,37继续培养4h后终止培养,吸弃孔内培养液;每孔加入150LDMSO,摇床上震荡10min,使结晶物充分溶解;在酶标仪上490nm波长处测定各孔光密度(OD)值。求出各实验组的细胞存活率。细胞存活率=实验组OD/对照组OD100%。1.4流式细胞术检测细胞凋亡峰及凋亡率细胞接种于6孔培养板,按上述要求给予不同因素的处理后,收集各组肝细胞,离心,PBS洗涤3次,70%冰乙醇固定,制成5106个/L细胞悬液,加样入流式细胞仪检测凋亡峰及凋亡率。1.5细胞内活性氧(ROS)的检测1.5.1显微镜观察及检测细胞内ROS各组处理时间终止后,用PBS洗涤3次,用10mol/LDCFH-DA染液于37孵育30min,PBS洗涤3次,以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA,于荧光显微镜下观察。1.5.2流式细胞仪检测胞内ROS各组处理时间终止后经PBS清洗2次,收集细胞,加入10mol/LDCFH-DA染液于37孵育30min,用PBS洗涤3次,以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA,用流式细胞仪以激发波长为488nm,发射波长525nm,检测平均荧光强度(MFI),该值代表细

参考文献

引证文献

问答

我要提问