他克莫司对糖尿病大鼠肾组织保护作用的初步探讨

作者:蔡珂丹;罗群;王来亮;高燕红;邬民香 刊名:现代实用医学 上传者:王士磊

【摘要】目的初步探讨新型免疫抑制剂他克莫司(FK506)对糖尿病肾病(DKD)大鼠肾组织足细胞的保护作用。方法制作链脲佐菌素诱导的大鼠DKD模型,随机分成正常对照组(N组)、DKD模型组(D组)和FK506干预组(F组)。F组大鼠每天灌胃FK506 0.5 mg·kg-1·d-1,D组和N组每天灌胃等量溶媒。于给药8周后观察各组大鼠各项生化指标、肾组织病理形态学改变;实时定量聚合酶链反应(PCR)、免疫印迹检测肾组织足细胞标志物nephrin m RNA、蛋白表达情况。结果 8周后,与N组比较,D组和F组的24 h尿蛋白、血肌酐、尿素氮、血糖水平均高(均<0.05);与D组比较,F组的24 h尿蛋白水平下降明显(<0.05),血糖、肌酐、尿素氮差异均无统计学意义(均>0.05)。光镜下,肾组织病理学观察N组无明显异常;D组可见肾小球毛细血管袢肥大,系膜细胞中度增生,细胞外基质增多,基底膜增厚;F组病理改变减轻。与N组比较,D组大鼠肾组织nephrin m RNA、蛋白表达显著下调(<0.05);与D组比较,F组大鼠肾组织nephrin m RNA、蛋白表达上调(<0.05)。结论 FK506可能部分通过调节nephrin表达,保护足细胞,维持裂孔膜完整,对肾脏损伤起到一定的保护作用,延缓糖尿病肾脏进展。

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糖尿病肾病(DKD)是引起终末期肾病的最主要病因之一,足细胞病变在DKD发生发展过程中占有重要作用,维持足细胞结构和功能的主要裂孔隔膜蛋白分子nephrin表达改变是足细胞损伤的重要标志。新型免疫抑制剂他克莫司(FK506)治疗足细胞病变有良好疗效[1]。本研究拟通过观察FK506对DKD大鼠尿蛋白及肾组织足细胞标志物nephrin表达的影响,探讨FK506对DKD大鼠肾保护作用的机制。报道如下。1资料与方法1.1实验动物与主要试剂6~7周龄雄性清洁级SD大鼠15只,体质量为(220.015.0)g,由浙江省动物实验中心提供。血糖试纸(美国强生),链脲佐菌素(strephtozotocin,STZ,美国Sigma),他克莫司(FK506,日本Fujisawa),RT-PCR试剂盒(大连TAKARA),nephrin引物(上海Invitrogen),兔抗大鼠neph-rin抗体(美国abcam)。1.2动物模型的建立和分组经随机数字表法将大鼠分成3组,其中10只大鼠造模,余下5只作为健康对照组(N组)。大鼠禁食12h后,单次无菌腹腔注射STZ65mg/kg。72h后尾静脉采血,测空腹血糖(FBG),16.7mmol/L确定为糖尿病大鼠。3周后留24h尿,测24h尿蛋白30mg,则确定DKD大鼠造模成功。10只大鼠造模均成功,经随机数字表法分成FK506组(F组)和DKD组(D组),各5只。F组大鼠每天灌胃FK5060.5mgkg-1d-1,D组和N组每天灌胃等量溶媒。8周后用代谢笼留取24h尿液,并杀死大鼠心脏取血4~6ml,分离双侧肾脏,部分肾组织以4%多聚甲醛固定,其余部分80冻存。1.3血、尿相关指标检测24h尿蛋白定量、FBG、血肌酐及尿素氮采用美国BeckcoulterDXC800全自动生化分析仪进行检测。1.4肾脏病理肾组织以4%多聚甲醛固定、石蜡切片,常规HE染色,光镜下观察肾脏组织形态学及结构的变化。1.5免疫印迹50g肾皮质的蛋白在12%十二烷基磺酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶上分离,转至NC膜上,5%脱脂牛奶封闭4h,用Tris缓冲盐水-吐温(TBST)溶液洗脱3次,每次5min。加入12000兔抗大鼠nephrin抗体,4过夜,用TBST溶液洗脱3次,每次5min,加入110000羊抗兔二抗,室温2h,用TBST溶液洗脱3次,每次10min;加入110000小鼠抗大鼠Tris缓冲盐水-吐温(GAPDH)抗体,用TBST溶液洗脱3次,每次5min,加入110000二抗(羊抗小鼠,Jackson),室温2h,用TBST溶液洗脱3次,每次10min;ECL系统显色。胶片扫描后用QuantityOne软件进行灰度分析。1.6实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测mRNA检测按照QIAGEN试剂盒说明书提取肾皮质总RNA,分光光度计法测定总RNA浓度,通过反转录酶合成cDNA。实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)体系参照TAKARA试剂盒说明。采用AgilentMx3000P进行实时PCR。PCR程序:预变性952min,PCR反应9530s,6030s,7230s,40个循环。结束后读取CT值,将各组目标基因的CT值与管家基因的CT值相减得CT,再将各组的CT与正常组的CT得CT,通过2CT方法分析各组间mRNA的表达情况。1.7统计方法采用SPSS18.0统计软件进行处理。计量资料以均数标准差表示,多组间比较采用单因素方差分析,两组间比较采用LSD-检验。<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1血、尿相关指标8周后,D组和F组的24

参考文献

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