纳米PLLA膜复合内皮生长晕细胞的相容性研究

作者:卢辉俊;冯章启;顾忠泽;刘长建 刊名:中国普外基础与临床杂志 上传者:王军凤

【摘要】目的通过观察内皮生长晕细胞(EOCs)与纳米聚-L-乳酸(PLLA)有序纤维膜体外复合培养的生物相容性及黏附、增殖情况,为构建组织修复材料提供理论依据。方法通过静电纺丝技术制备的纳米PLLA纤维支架,行低温等离子体技术改性及Ⅰ型胶原表面涂覆,与EOCs复合培养,测定细胞黏附率及增殖率,观察细胞生长曲线,荧光显微镜及扫描电镜下观察支架材料与种子细胞EOCs形态特征和生物相容性。结果制备的纳米PLLA膜孔径在300~400 nm之间,孔隙率>90%。各组(单纯细胞组、无序膜组、有序膜组及超级有序膜组)吸光度(A)值均随共培养时间的增加而逐步升高;从第5天起,有序膜和超级有序膜组A值与无序膜和单纯细胞组比较,差异有统计学意义(P<0.05);单纯细胞组和无序膜组各检测时间点A值差异无统计学意义(P>0.05)。复合培养12 h及24 h后有序膜组和超级有序膜组黏附率则明显高于无序膜组,差异有统计学意义(P<0.01)。复合培养1 d、3 d及7 d后,有序膜组和超级有序膜组的增殖率明显高于无序膜组(P<0.05,P<0.01)。细胞在支架膜上生长良好,纳米无序膜的细胞生长较散在、杂乱;有良好空间定向效果的有序膜及超级有序膜支架有利于细胞沿纤维定向附着、伸展、增殖,以超级有序膜更有利于保持其结构。结论EOCs是理想的组织工程种子来源细胞;纳米PLLA有序及超级有序膜支架能促进种子细胞在材料表面的黏附、增殖,并能较好地保持细胞的形态,是一种理想的组织修复材料。

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在生物医学领域,一些生物医用高分子材料通过静电纺丝(electrostaticspinning)技术制备的纳米纤维支架,因其形态结构与天然细胞外基质有较高的相似性,可用于多种组织的修复,如作为皮肤移植的垫片,炎症、溃疡、烧伤、创伤、医源性等原因造成的皮肤缺损的修复敷料等,在组织重建等领域显示出巨大的潜力[1-3]。本实验通过静电纺丝技术制备的纳米聚-L-乳酸(poly-L-lacticacid,PLLA)有序纤维膜与内皮生长晕细胞(EOCs)[4,5]体外复合培养,观察细胞的黏附、增殖情况及生物相容性,为以EOCs为种子细胞、纳米PLLA有序纤维膜为支架构建组织修复材料提供理论依据[6,7]。1材料与方法1.1主要材料和试剂新西兰大白兔1只,体质量2.5~3.0kg(金陵种兔场,生产许可证号:SCXK苏2002-0030),雌雄不限。纤维连接蛋白,Chemicon公司;兔淋巴细胞分离液,天津灏洋生物制品科技有限责任公司;DiI-ac-LDL,MolecularProbes公司;FITC-UEA-I,Sigma公司;EBM-2MV培养基(含EBM-2基础培养基以及rhEGF、VEGF、rhFGF-B、IGF-1等生长因子),Cambrex公司;CM-DiI,Invitrogen公司;胎牛血清,杭州四季青公司;胰蛋白酶,Gibco公司;型胶原蛋白,Sigma公司;酶联免疫检测仪,Tecan公司;日立S-3000N扫描电子显微镜(SEM),Hitachi公司。1.2纳米化PLLA的制备[2,8,9]将PLLA混合溶液(二氯甲烷及二甲基甲酰胺体积比31)搅拌2h,5000r/min(r=9cm)离心2h,离心后置溶液于玻璃注射器中(5ml,6号针头),针头处加10kV高电压,推进速度0.5ml/h,用收集装置接收纳米纤维,收集装置与针头间距离在15~20cm之间。利用静电纺丝技术将PLLA分别制备成纳米无序膜(铝箔平板型收集装置)、有序膜(金属丝滚筒接收器,1000r/min)及超级有序膜(金属丝滚筒接收器,2500r/min),室温真空干燥保存,皆行低温等离子体技术改性及型胶原表面涂覆,环氧乙烷消毒以备用。1.3兔外周血EOCs的分离和培养[5,10]麻醉后经兔心内采血20ml/只,肝素钠抗凝,PBS等体积稀释,加入预先加有比重1.096兔淋巴细胞分离液的离心管上层,分离液和稀释血体积比约为37,常温下2000r/min(r=10cm)离心30min,吸取中间白膜层细胞,PBS洗2次、离心2次(1000r/min5min),弃上清,留细胞沉淀,重悬于EBM-2MV(含15%的胎牛血清)全培养液中,以2106/ml密度接种于预先包被好纤维连接蛋白(5g/cm2)的25cm2培养瓶中,置培养箱中培养,3~4d后换半液,7d后每3~4d换全液1次。细胞生长达80%~90%融合时按照12或13传代培养。每天倒置相差显微镜下观察EOCs细胞生长状况。1.4DiI-ac-LDL和FITC-UEA-I双荧光染色鉴定EOCs[11]经体外诱导分化培养16d后的贴壁细胞与10mg/L的DiI-ac-LDL置培养箱孵育4h,PBS洗3次,2%多聚甲醛固定20min,PBS漂洗后,将10mg/L的FITC-UEA-I加入上述标本中37孵育1h,在倒置荧光显微镜下观察。1.5CM-DiI标记用1ml二甲基亚砜(DMSO)溶解CM-DiI后配制成2g/mlCM-DiIPBS溶液,细胞在贴壁状态下37孵育5min,415min,PBS洗2遍,荧光显微镜观察,胰酶/EDTA消化后,

参考文献

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