靶向mdr1基因shRNA真核表达载体的构建及鉴定

作者:干惠珠;张桂珍;张凤春;卜丽莎;杨绍娟;高申;郑德明 刊名:蚌埠医学院学报 上传者:周学安

【摘要】目的:设计并构建靶向mdr1基因shRNA真核表达质粒。方法:以mdr1为靶基因设计具有短发夹结构的模板寡核苷酸,退火形成互补双链结构,再克隆至pSilencerTM3.1-H1neo载体,构建重组的短发夹shRNA表达载体。采用酶切法和测序法鉴定。结果:经限制性内切酶酶切电泳后显示有66bp模板寡核苷酸片段和4.3kbp的线性化的pSilencerTM3.1-H1neo载体片段。重组子测序结果与Genebank中的mdr1基因cDNA序列相符。结论:重组靶向mdr1基因shRNA表达载体构建正确,为进一步转染耐药的肿瘤细胞逆转肿瘤耐药研究奠定了基础。

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多药耐药(MDR)是指肿瘤细胞不单对原来使用过的药物产生耐药,同时对与之结构、作用机制完全不同的药物也产生交叉耐药[1]。肿瘤产生MDR的分子机制最重要的是跨膜药泵基因P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)/mdr1的扩增或过表达。MDR已成为恶性肿瘤治疗的难点。RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是通过转录后基因沉默抑制目的基因表达的一种新技术。RNAi与反义寡核苷酸和反义RNA技术相比具有较大优点,国外曾有利用RNAi技术抑制mdr1基因表达的报道[2,3]。为进一步逆转肿瘤多药耐药性,本研究采用体内转录合成法,构建2个靶向mdr1发夹shRNA表达载体,转染耐药的肿瘤细胞,为探讨逆转肿瘤多药耐药的新方法奠定基础。1材料与方法1.1质粒和菌株pSilencerTMneo3.1-H1siRNA表达载体购自美国Ambion公司。大肠埃希菌JM109由吉林大学中日联谊医院中心研究室提供。1.2主要试剂和设备T4DNA连接酶购自美国Promega公司;BamH和Hind内切酶购自大连宝生物工程公司;去核酸酶水购自美国Promega公司;琼脂糖购自美国Sigma公司;DNApurificationsystemWizard(plusSVMinipreps购自美国Promega公司;琼脂粉购自上海化学试剂厂;DNAMarkerDL2000购自大连宝生物工程公司。主要仪器:低温高速离心机(Hitachi公司);U-3410型紫外分光光度仪(日本日立公司);GeneAmpPCRSystem9700(美国PE公司);AEL-40S型电子分析天平(日本岛津公司);DYY-28A型转移电泳仪(北京六一仪器厂);GIS-2008凝胶图像分析系统(上海天能科技有限公司)。1.3mdr1基因shRNA模板寡核苷酸的设计和合成根据GenebankP-gp编码基因mdr1cDNA的已知序列,参照文献[2,3],在核苷酸2745-2765、3563-3583之间选择2个19bp的shRNA特异性靶位点序列(基因编号AF016535)。经搜索BLAST数据库未发现有其它基因与此序列有同源性。互补的寡核苷酸模板编码针对所设计的mdr1mRNA靶位点,2个互补的反向重复序列之间插入9bp非同源序列TTCAAGAGA。发夹shRNA模板寡核苷酸的3末端是5个胸腺嘧啶(T),作为RNApol的终止信号;其5、3末端分别是BamH和Hind的限制性酶切位点。采用化学合成法合成单链mdr1shRNA模板寡核苷酸。稀释发夹shRNA模板寡核苷酸至终浓度为1g/l。shRNA模板寡核苷酸序列分别如下:2745-2765RNAPolBamHSenseStrandLoopAntisenseStrandTerminateHind5GATCCC-AATGTTGTCTGGACAAGCA-TTCAAGAGA-TGCTTGTCCAGACAACATT-T-GGAAA33GG-TTACAACAGACCTGTTCGT-AAGTTCTCT-ACGAACAGGTCTGTTGTAA-A-CCTTTCGA53563-3583RNAPolBamH1SenseStrandLoopAntisenseStrandTerminateHind5GATCCC-AGGAGGCCAACATACATGC-TTCAAGAGA-GCATGTATGTTGTCCTCCT-T-GGAAA33GG-TCCTCCGGTTGTATGTACG-AAGTTCTCT-CGTACATACAACCGGAGGA-A-CCTTTCGA5将一

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