食品中大肠埃希氏菌、沙门氏菌整合子的耐药性水平传递研究

作者:刘渠;刘衡川;白松涛;李灶平;张茂棠;林斯星;古锦泰 刊名:现代预防医学 上传者:吴浪

【摘要】探讨整合子在细菌耐药性的获得及传递中的作用。方法 :采用膜接合试验。结果 :菌株之间的接合频率在 1 0 - 1~ 1 0 - 5之间。结论 :整合子可发生水平传递 ,同时整合子可捕获或丢失基因盒 ,造成耐药基因的水平播散。

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整合子能不断地积累、更新基因盒,不同整合子之间、整合子与细菌的基因组之间、整合子与外环境之间会发生基因盒的交换。本研究试图通过膜接合试验,模拟自然界中细菌之间发生基因水平的条件,探讨食品中大肠埃希氏菌、沙门氏菌整合子的耐药性整合子水平传递的方式。1材料与方法1.1材料1.1.1供体和受体菌株根据细菌的耐药表型,以氨苄西林、链霉素、四环素3种抗生素作为接合子的筛选条件,选择自然分离的菌株作供体菌和受体菌。供体菌为食品中大肠埃希氏菌、沙门氏菌整合子阳性菌株(包括整合子在质粒和染色体上的菌株),受体菌为整合子阴性菌株或携带有与供体菌不同大小的整合子的阳性菌株。接合试验的供受体菌及其抗性标记见表1和表2。1.1.2培养基与配制1.1.2.1抗生素溶液:氨苄西林(10mg/ml),四环素(10mg/ml),链霉素(10mg/ml),购自上海生工生物工程公司。1.1.2.2LB肉汤:胰蛋白胨(Bacto-Tryptone,Oxide)10g、酵母提取物(Oxide)5g、氯化钠(AR)10g,溶于800ml去离子水,调pH7.4,加水至1000ml,每管5ml分装,压力蒸汽12115min灭菌。1.1.2.3LB琼脂:胰蛋白胨(Oxide)10g、酵母提取物(Oxide)5g、氯化钠(AR)10g,溶于800ml去离子水,调pH7.4,加入20g琼脂粉,加去离子水至1000ml,121压力蒸汽灭菌。1.1.2.4HE琼脂、伊红美兰(EMB)琼脂:购自北京陆桥技术有限公司,按产品说明配制,压力蒸汽灭菌。1.1.2.5含抗生素的选择性培养基:待在上述培养基冷至5254,添加一定量的抗生素溶液,使液体培养基中氨苄西林和链霉素的浓度为50mg/ml,四环素的浓度为20mg/ml。固体培养基中氨苄西林和链霉素的浓度为100mg/ml,四环素的浓度为40mg/ml。1.1.3引物:对1类整合子可变区扩增用的引物P3和P4,对2类整合子扩增用的引物P7和P8。1.1.4工具酶:snTaqDNA聚合酶1.1.50.45m孔径滤膜:为Millipore公司产品。1.2方法1.2.1接合试验方法1.2.1.1供、受体菌株分别在添加了选择性抗生素(50mg/ml氨苄西林、50mg/ml链霉素或20mg/ml四环素)的LB肉汤中,37220r/min恒温振荡培养16h18h。1.2.1.2用岛津DNA/RNA/protein紫外可见分光光度计测定细菌的LB肉汤培养物在波长600nm的吸光度值,粗略估计细菌浓度,稀释到108cfu/ml。1.2.1.3取稀释好的供、受体菌液各0.5ml,在1.5mlEp-pendorf管中混合均匀,12000g3min离心。用37预热的LB肉汤离心洗涤两次。1.2.1.4倾注LB琼脂平板,3710min烘干后,贴上已经灭菌的滤膜。1.2.1.5用50l37预热的LB肉汤重悬细菌沉淀,然后转种至滤膜上,均匀涂布。37恒温培养箱中培养18h24h。1.2.1.6取下滤膜,用5mlPBS溶液振荡洗下菌苔,作适当稀释,取0.5ml接种平板,371824h培养计数。用含双抗(氨苄西林100mg/ml+链霉素100mg/ml或氨苄西林100mg/ml+四环素40mg/ml或链霉素100mg/ml+四环素40mg/ml)的培养基筛选接合子。当接合试验是在两株沙门氏菌或两株大肠杆菌之间进行时,用含双抗的LB琼脂培养基;当接合试验是在大肠杆菌和沙门氏菌之间进行时,根据受体菌株是大肠杆菌或沙门氏菌选择含双抗的EMB琼脂或HE琼脂筛选接合子。供、受体菌分别用含选择性抗生素

参考文献

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