银杏叶提取物对热应激致鸡心肌细胞氧化损伤的保护作用研究

作者:陈洪博;段滇宁;王华; 刊名:中国畜牧兽医 上传者:陈迎

【摘要】本试验旨在研究银杏叶提取物(Ginko biloba extract,GBE)对热应激致鸡心肌细胞氧化损伤的保护作用。取12日龄AA肉鸡心脏制备鸡原代心肌细胞,向原代心肌细胞培养板中分别加入0、5、10、50、100、150 mg/mL GBE,CCK-8试剂盒检测心肌细胞存活率;将原代心肌细胞以1×104个/孔接种于96孔板,培养48h,分别加入0、5、10、50、100、200、500、1 000μg/mL GBE,Hoechst 33258检测心肌细胞凋亡率,确定最适GBE浓度。42℃热应激处理(0、0.5、1、2和4h)建立心肌细胞损伤模型,ELISA试剂盒检测乳酸脱氢酶(LDH)、细胞丙二醛(MDA)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)含量,以及超氧化物歧化酶(SOD)活性;Western blotting检测Hsp72蛋白表达。结果显示,高浓度GBE具有细胞毒性,50、100、150mg/mL GBE能极显著抑制细胞生长(P<0.01),50μg/mL GBE能够极显著提高细胞增殖率(P<0.01)。热应激后细胞发生凋亡,细胞内MDA、LDH含量增加,SOD活性、GSHPx含量减少,产生氧化损伤;GBE可以降低热应激时细胞LDH和MDA的含量,增加SOD活性和GSH-Px的含量,热应激2、4h,GBE处理效果明显。此外,GBE可增加心肌细胞中Hsp72蛋白的表达。综上所述,GBE能降低热应激状态下心肌细胞的氧化损伤,其机制可能与提高抗氧化酶活性及提高Hsp72的表达有关。

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热应激可导致动物机体多个器官功能障碍,包括心脏,心肌细胞损伤是导致热应激猝死的原因之一[1]。由于自身的生理结构及生长代谢等特点,家禽更容易受到热应激损伤,热应激可改变心肌细胞膜的通透性,导致一些酶如CK-MB、LDH的释放[2]。此外,热应激还可导致组织器官出现明显的病理损伤。前期研究显示,热应激后心肌细胞出现颗粒变性、空泡变性,细胞核浓缩深染,甚至心肌纤维断裂[3-4]。因此,研发心脏保护药物,减少热应激损伤尤为重要。银杏叶提取物(Ginkgo biloba extract,GBE)含黄酮类、萜类、酚类等多种活性成分,其药用价值大,在抗炎、抗过敏、保护心脑血管、改善外周血液循环、降低血清胆固醇及辅助抗癌等方面发挥重要作用,广泛应用于心脑血管、神经系统疾病的防治。研究发现,GBE可提高肉鸡产肉性能、免疫性能、血清球蛋白水平和抗氧化能力,抑制过氧化氢、氯化铝、糖基化终产物、酒精、一氧化氮合酶、三氧化二砷等对细胞的氧化损伤,但GBE能否缓解热应激所致的鸡原代心肌细胞的氧化损伤,目前还未见报道[4-8]。因此,本试验旨在研究GBE对热应激诱导的原代心肌细胞氧化损伤的保护作用,探讨GBE可能的作用机制,旨在为预防家禽热应激提供新思路。1材料与方法1.1材料银杏叶(树龄5~10年,采摘季节9~10月份)由福建长汀树王银杏叶生态园有限公司提供;CCK-8、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒均购自碧云天生物技术有限公司;Hsp72抗体购自Enzo Life Sciences公司;Ⅰ型胶原酶购自Vetec公司。1.2方法1.2.1银杏叶提取物的制备采用水煮醇提物法[9],将银杏叶60目粉碎后取10g,分别用6、8、10倍超纯水浸泡蒸馏煮提3次,回收蒸馏液,去渣,合并3次滤液,4层纱布过滤,经旋转蒸发仪浓缩至10mL。加入无水乙醇,使乙醇浓度达75%,调节pH为6.8~7.2,4℃冰箱冷藏48h后,滤纸过滤去除沉淀物质,旋转蒸发仪回收乙醇,冷却后再次加入无水乙醇,使其浓度达85%,重复以上操作,回收乙醇,最后加入1mL蒸馏成分和0.5mL吐温-80充分混合后用无菌水调节至10 mL,终浓度为1g/mL。1.2.2鸡原代心肌细胞制备无菌取出12日龄AA肉鸡心脏,PBS洗涤3次,用眼科剪将心脏组织剪碎,加入Ⅰ型胶原酶浓缩液(终浓度1 mg/mL),将培养皿置于4℃冰箱中消化16h。用移液枪轻轻连续吹打,使心肌细胞充分散开,1 000r/min离心10min,弃掉上清,将细胞重悬转移到新的60 mm的细胞培养皿中,置于37℃、5%CO2培养箱差速贴壁1h,收集细胞悬液,调整细胞浓度为0.4×106个/mL,细胞铺板后加入溴脱氧尿苷(BRDU,终浓度6μmol/L),培养48h后换液并加药继续培养24h,备用。1.2.3 GBE对原代心肌细胞存活率的影响向原代心肌细胞培养孔中加入不同浓度GBE,终浓度分别为0、5、10、50、100、150mg/mL,培养24h,更换新培养液,CCK-8试剂盒检测细胞存活率。1.2.4 GBE对原代心肌细胞增殖的影响将原代心肌细胞以1×104个/孔接种于96孔板,培养48h,将细胞分为空白组、加药组(GBE浓度分别为0、5、10、50、100、200、500、1 000μg/mL),继续培养24h,更换新培养液,CCK-8试剂盒检测细胞活力,筛选原代心肌细胞增殖的最佳浓度用于后续试验。1.2.5 MDA、SOD、GSH-Px和LDH的检测原代心肌细胞加GBE(1

参考文献

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