MiR-3622a通过LASS2调控对膀胱癌细胞的生物学行为影响

作者:蒋昌毅;柯昌兴;叶枝能;黄津;龚年东;王海峰; 刊名:现代泌尿外科杂志 上传者:贾春阳

【摘要】目的探讨人微小核糖核酸3622a(miR-3622a)通过人源性长寿保障基因2(LASS2)调控膀胱癌细胞的生物学行为。方法通过脂质体转染将靶向LASS2的实验组(miR-3622amimic)、阴性对照组(miR-NC mimic)、空白组(control)转染EJ、BIU、RT4细胞,运用实时定量逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)和蛋白质印迹法(Western blot)检测转染后LASS2mRNA和蛋白的表达。应用细胞增殖活性检测试剂盒(Cell Counting Kit-8,CCK-8)和细胞划痕实验检测膀胱癌细胞的细胞增值和迁移能力。结果miR-3622amimic组和miR-NC mimic、Control组相比,LASS2的mRNA及蛋白水平上均明显下降(mRNA:F=93.91,P<0.001;蛋白:F=4.62,P<0.05),同时细胞增值和迁移能力增加(P<0.05)。MiR-NC mimic和Control组之间无明显差异(P>0.05)。结论靶向LASS2的miR-3622a能有效下调LASS2基因表达,并能提高膀胱癌EJ、BIU、RT4细胞增值和迁移能力。

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膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一,其发病率呈逐年上升趋势[1],男性的发病率高于女性[2]。近年来,随着基因治疗在临床中的开展,寻找膀胱癌的分子靶点对临床的治疗、预后具有十分重要的意义。微小核糖核酸(microRNAs,miRNAs)在真核细胞中广泛存在,调控着细胞的生物学功能[3]。文献报道,miRNAs调节近30%的人类基因组蛋白编码基因[4],可负性调控靶基因使基因的转录水平下降。miR-3622a具有与miRNAs类似的特性,在相应的疾病进程中起到一定的调控作用[5]。人源性长寿保障基因2(homo sapiens longevity assurance homologue2,LASS2),也被命名为肿瘤转移抑制因子,目前已被证实LASS2在前列腺癌、膀胱癌、肝癌、乳腺癌等多种肿瘤中发挥着抑癌基因的作用[6]。在本研究中,我们构建miR-3622amimic表达载体,并转染膀胱癌细胞EJ、BIU、RT4,探讨miR-3622a通过LASS2调控对膀胱癌细胞增值、迁移能力的影响,为膀胱癌远期的基因治疗提供理论基础。1材料与方法1.1材料膀胱癌细胞株EJ、BIU、RT4(昆医附二院中心实验室)、RPMI(美国Hyclone公司)、胎牛血清购(南美乌拉圭CELL-BOX公司)、Trizol(日本TaKaRa公司)、FastKing cDNA第一链合成试剂盒、Talent荧光定量检测试剂盒(中国北京天根生化公司);引物(昆明硕擎公司)、LASS2一抗和Beta-Ac-tin一抗和羊抗兔二抗HRP标记(美国Millipore公司)、CCK-8(中国汉恒生物有限公司);全自动凝胶图像分析(美国Bio-rad)、荧光定量PCR仪7000型(美国ABI公司)。1.2方法1.2.1细胞培养含10%胎牛血清的细胞培养基(RPMI)培养膀胱癌细胞株,于37℃、5%CO2(体积分数)培养箱中孵育,每2d传代1次。1.2.2细胞转染按照汉恒生物转染试剂说明书进行转染。转染前1d,将3×105/孔EJ、BIU和RT4细胞分别接种到2mL含10%胎牛血清的RPMI培养液的6孔板进行培养,使细胞能够在24h细胞密度为80%~90%左右。按照以下方法准备miR-3622amimic,miR-NC mimic,脂质体转染试剂(Li-pofiter)复合物:(1)以250μL减血清培养基(Opti-MEMRI)稀释7.5μL Lipofiter转染试剂,轻轻混匀,室温条件下孵育5min;(2)以250μL Opti-MEM-RI稀释miR-3622amimic或miR-NC mimic3μg,混匀,室温条件下孵育5min;(3)将(1)转入(2)中,清清吹打混匀,在室温条件下孵育20min,以利于形成复合物。将(3)复合物均匀加入6孔板中,转染后12h更换培养基。37℃条件下,5%CO2(体积分数)培养箱继续孵育48h。1.2.3总RNA提取和cDNA合成按照TAKA-RA试剂说明书提取细胞总RNA。用紫外分光光度仪在A260/A280检验RNA纯度并计算其浓度。cDNA第一链合成反应体系:5×gDNA缓冲液2μL,总RNA 50ng~2μg;10×King RT Buffer 2μL,FastKing RT Enzyme Mix 1μL,FQ-RT Primer Mix2μL,RNase-Free dd H2O至总体积20μL。反应条件为:42℃,60min;95℃,3min。所获得cDNA于-20℃保存备用。1.2.4实时定量逆转录聚合酶链反应(ReverseTran

参考文献

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