一种小粒径壳聚糖纳米粒作为基因载体的研究

作者:张文华;梁晔;周泉;李彤;李明钰;苗玉;徐文华;王丽萍; 刊名:功能材料 上传者:张瑞娜

【摘要】系统比较了不同分子量的壳聚糖与TPP离子交联制备的纳米粒,用于基因转运载体,评价其对质粒和siRNA的转运效果。通过粒度仪测定壳聚糖纳米粒(CSNPs)的粒径、多分散系数以及Zeta电位;透射电镜观察CSNPs的形态;MTT法测定其细胞毒性;通过CSNPs在小鼠肌肉内的组织切片观察其生物相容性。CSNPs分别包载质粒和siRNA,凝胶电泳和分光光度法测定其包载能力,荧光显微镜、激光共聚焦或流式细胞术分析其对肿瘤细胞的转染效果;溶血实验和血凝实验分析其血液相容性。结果表明,1 mg/mL的CS(160 k Da)和TPP(质量比为10∶1)制备的CSNPs粒径约100 nm,且分布均一、稳定,透射电镜下为形态规则的类球型粒子;其细胞毒性均在0~1级,符合生物医用材料毒性标准;组织切片没有发现明显的炎症反应,生物相容性良好;CSNPs对质粒和siRNA的包载率较高,并能成功将其转运至细胞内,但小粒径的纳米粒转染质粒后荧光较弱,而携带siRNA的CSNPs转染后荧光较强,且流式细胞术结果表明其与商品化转染试剂相比转染率较高;溶血及血凝实验也发现材料具有良好的血液相容性。所以,制备的小粒径CSNPs更适合作为一种安全高效的siRNA转运载体,后续可以加以修饰应用于肿瘤的基因靶向治疗中。

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0引言基因转运系统可应用于疾病治疗,在医学、药学和生物技术领域受到了极大的关注[1-2]。基因治疗的关键是寻找合适的安全高效的转运载体。近年来,聚合物纳米粒子因其具有调节药物释放以及延长体内循环时间等优点,而被广泛应用于药物治疗[3-4]。壳聚糖(chitosan,CS)是天然阳离子多糖,通常存在于甲壳纲动物、昆虫和真菌的外骨骼上[5-6]。其骨架上含有大量游离氨基和羟基,因此能通过物理和化学交联形成纳米粒[7-8]。其中,最经典的方法是将CS与带负电的多价离子三聚磷酸钠(tripolyphosphate,TPP)交联形成纳米粒[9-10]。壳聚糖纳米粒(chitosan nanop-articles,CSNPs)具有稳定性好、毒性低、免疫原性低和生物相容性高等特点[11-14],而且其结构简单,易于制备,为给药提供了多种途径,作为药物转运载体受到了极大关注[15-17]。CS骨架上的游离氨基使其带正电荷,可以很容易地结合带负电荷的生物分子,如寡核苷酸,因此,CSNPs也可以作为一种具有应用潜力的基因载体[18-19]。很多研究将CSNPs作为质粒载体、siRNA载体或质粒与siRNA混合物载体,但是,对于小粒径(100 nm)的CSNPs究竟适合于转运哪种基因产物尚无明确的定论,本文对CSNPs更适合于转运质粒还是siRNA作出比较,为后续将CSNPs应用于肿瘤的基因靶向治疗提供必要依据。本文系统比较了不同分子量的CS以及不同浓度、质量比的CS和TPP制备的CSNPs,通过粒度仪测定CSNPs的粒径、多分散系数以及zeta电位,透射电镜观察CSNPs的形态,并对其细胞毒性和生物相容性进行研究,用CSNPs分别包载质粒和siRNA转染细胞,比较其转染效果,并分析其血液相容性,从而系统评价小粒径CSNPs对于转运基因产物的可行性。1材料与方法1.1主要实验材料与仪器壳聚糖(CS,Mw=160,327 k Da),Sigma-Aldrich;三聚磷酸钠(TPP):Sigma-Aldrich;MTT:Sigma-Aldrich;昆明小鼠(20g~22 g):青岛大学附属医院实验动物中心;A549和L929细胞系:中国科学院细胞库;质粒(p IRES2-EGFP):实验室制备;siRNA:上海吉玛;Lip3000:Invitrogen;Hiperfect:QIAGEN;DMEM、1640培养基:Gibco;其它试剂均为分析纯。Nanotrac wave型粒度分析仪(美国Microtrac);JEM-1200EX型透射电镜(日本JEOL);SPE型激光共聚焦显微镜(德国Leica);IX71型荧光显微镜(日本Olympus);FACS Calibur流式细胞仪(美国BD);CA7000型全自动血凝仪(日本Sysmex)等。1.2 CSNPs的制备用离子交联法制备CSNPs[20],称取适量CS粉末(160,327 k Da),室温下溶于0.5%的乙酸溶液,制备浓度为1与2.5 mg/m L的CS乙酸溶液,用0.45μm滤器过滤,将其p H值调为4~5。称取适量TPP粉末,室温下溶于超纯水,制备浓度为1和2.5 mg/m L的TPP溶液,用0.45μm滤器过滤。在磁力搅拌500 r状态下,将TPP缓慢滴加到CS乙酸溶液中,使CS和TPP的质量比分别为10∶1和5∶1,持续搅拌30 min后,超声处理2 min,静置15 min后得到CSNPs溶液。1.3比较粒径和zeta电位用粒度仪分析比较各种CSNPs的平均粒度、多分散系数(polydispersity

参考文献

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