天麻种子与真菌共生萌发的蛋白组学研究

作者:曾旭;杨建文;凌鸿;张盈;陈娟;郭顺星; 刊名:菌物学报 上传者:唐英玲

【摘要】天麻Gastrodia elata是典型的腐生型兰科药用植物,其种子萌发需要小菇属Mycena真菌的侵染和共生,目前天麻种子共生萌发分子机制是该领域的热点问题。我们首次对天麻种子共生萌发过程进行了系统的蛋白质组学研究。采用i TRAQ标记的液质联用技术,成功鉴定了天麻成熟种子和萌发后原球茎的蛋白质组,共鉴定蛋白1 769个(global FDR 1%)。两组进行了差异蛋白质组学研究,获得差异蛋白269个。差异蛋白GO注释结果表明,在天麻种子共生萌发过程中,差异蛋白参与的功能和生物过程多样,以催化和结合为主,还参与感知环境刺激、分子信号等功能。KEGG代谢通路分析表明,差异蛋白还主要参与了转导、能量代谢、次生代谢和环境适应等过程。我们发现,一些参与内吞作用的蛋白在共生萌发过程中存在差异表达,表明内吞可能参与到二者互作过程中。对差异蛋白质组的深入解析和研究有利于揭示天麻种子共生萌发的分子机制,具有较强的理论和现实意义。

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天麻Gastrodia elata Blume为兰科药用植物,无明显的根及绿叶,不能进行完整的光合作用。天麻种子无胚乳及其他营养储备,仅由胚及种皮构成,胚组织无器官分化。长期研究发现,天麻为真菌寄养型植物,或称为食菌植物。早在1911年,日本科学家便报道了天麻与蜜环菌的共生关系,自此开始了对天麻的内生真菌研究(Kusano 1911)。我国科学家经长期深入的研究与开发,将紫萁小菇、石斛小菇等利于天麻种子萌发的共生萌发菌应用于栽培生产(徐锦堂和郭顺星1989;兰进等2002)。天麻种子萌发依靠小菇属真菌作用提供营养,其后形成的原球茎依靠同化蜜环菌正常生长,这种先后利用不同属真菌的生活经历,也成为天麻有别于其他兰科植物的重要特征。 在天麻种子萌发方面,能够促使天麻种子萌发的小菇属真菌不止一种,而且小菇属真菌能够广泛地促使兰科种子萌发(徐锦堂和郭顺星1999)。徐锦堂和郭顺星(1988)从天麻产区种子发芽的原球茎中分离出12种促进种子萌发的有效菌株,说明供给天麻种子萌发营养的真菌不是专一的。其中较优良的1株菌,经鉴定为紫箕小菇Mycena osmundicola J.E.Lange。天麻种子伴播该菌,发芽率在20%以上。该研究发现,蜜环菌对种子萌发有显著抑制作用。从种子萌发到原球茎生长,并分化生长出营养繁殖茎的整个阶段,都需要消化侵入的紫箕小菇等萌发菌获得营养。通过天麻种子与石斛小菇Mycena dendrobii L.Fan et S.X.Guo的共生试验表明,石斛小菇能与天麻共生,促进天麻种子发芽并形成原球茎,进一步证实了天麻种子可与一种以上的真菌共生(范黎等1999;徐锦堂等2001)。范黎等(1996)研究发现,用分离自墨兰菌根的兰小菇Mycena orchidicola Fan et Guo培养染菌树叶后,伴播天麻等12种兰科药用植物和花卉的种子,培养到62d时测定其发芽率,结果表明该真菌对天麻、报春石斛、长苏石斛、鼓槌石斛、密花石斛这5种植物种子萌发的促进作用是非常显著的。但兰小菇对墨兰种子没有促进作用,这表明从成年兰根中分离的真菌,虽然能与其共生,但是不一定能促进其萌发。 目前,有关天麻种子接菌萌发的蛋白组还未见报道。为探索天麻种子萌发的蛋白分子机制,本研究利用i TRAQ标记技术,首次对天麻的蛋白质组进行了系统的研究,为后期深入研究天麻提供坚实的理论基础。 1材料与方法 1.1实验材料 天麻种子采自陕西略阳天麻种植基地,经过中国医学科学院药用植物研究所郭顺星研究员鉴定。萌发菌石斛小菇23号由本实验提供,共生萌发实验参考徐锦堂等(2001)的方法,采用“树叶菌床法”,简要操作如下:灭菌后的壳斗科植物树叶放置于马铃薯琼脂培养基(potato dextrose agar,PDA)上,再接石斛小菇共同培养2周后,每日观察,待菌丝长满树叶,即得到菌叶;取出菌叶,放置于充分润湿水分的海绵垫上,将新鲜采收的天麻种子均匀的撒在菌叶表面;室温下,暗培养2周后显微观察,分别取天麻种子和原球茎,组成实验材料。所有材料用吸水纸轻轻吸去水分,立即在液氮中速冻,保存于-80℃超低温冰箱备用。 1.2透射电子显微镜观察 将采集的天麻原球茎放入含有2%多聚甲醛和2.5%戊二醛的0.1mol/L磷酸钠缓冲液(p H 6.8)中,4℃固定过夜,用磷酸缓冲液漂洗3次,每次15min。然后将材料放入含有1%的四氧化锇缓冲液中室温下固定4h,取出废液,再次用磷酸缓冲液漂洗样品3次,每次15min,之后用梯度浓度的乙醇溶液对样品进行脱水处理。树脂包埋(Electro

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