铁皮石斛SRAP体系优化与品种聚类分析

作者:袁晨琳;魏鹏;查学强;罗建平 刊名:中药材 上传者:梁土仙

【摘要】目的:建立并优化铁皮石斛SRAP-PCR反应体系,对7个产地铁皮石斛进行遗传多样性分析。方法:CTAB法提取石斛总DNA,单因素实验优化铁皮石斛SRAP-PCR的反应体系;组间平均连锁法对7个产地铁皮石斛进行系统聚类分析。结果:铁皮石斛SRAP-PCR模板30 ng时最适宜的扩增体系为:引物浓度0.10μmol/L、dNTP浓度0.25 mmol/L、Mg2+浓度2.0 mmol/L、Taq酶浓度1.5 U,4对引物组合对7个产地铁皮石斛进行扩增,共得到77条条带,其中特异性分子标记39个,多态率达51%,聚类分析将7个产地铁皮石斛分为4类。结论:建立了合适的铁皮石斛SRAP-PCR反应体系,不同产地的铁皮石斛之间具有丰富的遗传多样性,其遗传差异与地理分布之间无较大关联。

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铁皮石斛DendrobiumofficinaleKimuraetMigo是兰科石斛兰属多年生附生草本植物,主要分布于浙江、广东、广西、湖南、江西、云南等地,其干燥茎是我国传统的名贵中药材,具有降低血糖、提高机体免疫、抗癌、抗氧化等作用1。近年来,由于过度采挖,加上其苛刻的生长环境,野生的铁皮石斛资源已日渐枯竭。因此,建立一种合适的方法对铁皮石斛进行有效的遗传多样性分析,对于正确制定铁皮石斛的保护策略具有重要的意义。相关序列扩增多态性(Sequence-RelatedAmpli-fiedPolymorphism,SRAP)是一种新型的基于PCR的标记系统,最早由Li和Quiros2于2001年提出并应用于芸薹属作物。该方法操作简便、高效、成本低、共显性高、重复性好,已开始应用于植物品种鉴定、指纹图谱构建、遗传多样性分析等领域3,但其稳定性易受体系中引物、dNTP、Taq酶、Mg2+浓度等因素的影响。本研究将对铁皮石斛SRAP-PCR体系进行优化,并用优化的SRAP-PCR构建铁皮石斛分子指纹图谱,对不同产地的铁皮石斛进行遗传距离和聚类分析,以期为深入开展铁皮石斛种质资源鉴定及遗传变异研究提供理论依据及技术支持。1材料与仪器1.1材料本实验所使用的野生铁皮石斛药材主要由浙江乐清龙泰枫斗有限公司提供并鉴定,药材采自浙江、广西、江西、湖南、广东、云南等省,共7个野生居群,均为2007年采集,药材产地见表1。表1铁皮石斛样品编号及产地样品编号产地P1浙江温州P2浙江雁荡山P3广西P4江西P5湖南P6广东P7云南 1.2试剂PCR扩增试剂盒(上海生工生物技术有限公司),CTAB(北京欣经科生物技术公司),Maker:100bpDNALadder(北京赛百盛公司),SRAP引物(上海生工生物技术有限公司),Tris(上海东风生化技术有限公司),其他试剂均为国产分析纯。1.3仪器电泳仪(北京六一仪器厂),UV-1600紫外可见分光光度计(北京瑞利分析仪器公司),基因扩增仪(PE公司),GL-20G-冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂),SZ-2自动双重纯水蒸馏器(上海沪西分析仪器厂),凝胶成像仪(Bio-Rad)。2方法2.1铁皮石斛基因组DNA的提取与检测选取各产地石斛的新鲜叶片用CTAB法4提取石斛总DNA。所提DNA用紫外分光光度计测定含量。将各模板DNA浓度稀释至10ng/L,于-20冰箱保存备用。2.2引物的设计参考相关文献方法5,6,实验设计了上游引物和下游引物各2种,两两组合成4对引物,对所提DNA进行扩增。引物序列见表2。表2SRAP引物序列引物名称序列长度/bp上游引物Me45'-TGAGTCCAAACCGGACC-3'17Me55'-TGAGTCCAAACCGGAAG-3'17下游引物Em55'-GACTGCGTACGAATTAAC-3'18Em65'-GACTGCGTACGAATTGCA-3'182.3实验设计反应体系中的4种主要成分分别设置梯度:(1)引物:0.01、0.05、0.10、0.15、0.20、0.30、0.40mol/L;(2)dNTP:0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35mmol/L;(3)Mg2+:1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0mmol/L;(4)Taq酶:0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0U。以浙江温州产地的铁皮石斛基因组DNA30ng2为模板,以引物Me4-Em6对SRAP-PCR反应体系进行单因素优化实验,对引物浓度进行优化时,体系中其他因素浓度设为:dNTP

参考文献

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