大黄酚对神经细胞缺氧损伤的保护作用

作者:张明;荔志云;赵红斌;周杰;武弋;季玮;孙建军;李长栋 刊名:中华神经外科疾病研究杂志 上传者:焦薇薇

【摘要】目的观察大黄酚对缺氧PC12细胞损伤的保护作用;方法培养PC12细胞,建立缺氧致神经细胞损伤模型;缺氧前后四甲基偶氮唑盐法(MTT)检测PC12细胞增殖活性、光镜观察PC12细胞形态、测定上清液中乳酸脱氢酶(LDH)活性、早期癌基因表达产物(c-fos)荧光免疫组化表达和逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)分析神经型一氧化氮合酶(nNOS)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA的表达;结果大黄酚明显改善缺氧PC12细胞的活力,对损伤细胞形态有改善作用,使损伤细胞的培养上清液中的LDH明显减少;c-fos表达减少,PCR结果分析显示nNOS mRNA在缺氧早期表达。iNOSmRNA主要在缺氧晚期表达。结论本缺氧模型能够引起PC12细胞凋亡现象,大黄酚能减轻PC12细胞缺氧损伤,对神经元细胞有保护作用。

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各种原因造成的神经细胞缺氧可使神经细胞发生损伤。在神经细胞损伤的不同环节,通过阻断引起神经细胞坏死凋亡的级联反应,提高或改善细胞在缺氧环境中的内环境稳态、代谢功能、关键酶、部分基因的表达,均有利于神经细胞抗缺氧能力增强、修复机能改善、进而提高神经细胞存活能力。研究显示:大黄酚能够增强血液中谷胱甘肽过氧化物酶(glutathioneperoxidase,GSH-PX)和超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)的活力,能抗缺血损伤[1];能降低小鼠脑内一氧化氮(nitricoxide,NO)含量和一氧化氮合酶(nitricoxidesynthase,NOS)活性,明显改善东莨菪碱所致小鼠空间学习记忆障碍[2];能明显减少脑缺血再灌注小鼠脑内H2O2含量,明显提高脑缺血再灌注小鼠脑内过氧化氢酶(catalase,CAT)活力[3]。目前对大黄酚的研究主要是动物创伤模型,对体外培养细胞的作用研究报道不多。因PC12细胞是大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤分化株,具有神经元特征,广泛用于神经生理药理研究[4]。本文采用缺氧致PC12细胞损伤模型模拟缺血缺氧性脑血管疾病病理过程,观察大黄酚对缺氧致PC12细胞的保护作用。材料与方法一、主要试剂及仪器大黄酚购自陕西信瑞生物科技公司(SR-20100902,98%);PC12细胞(兰州大学基础医学院惠赠)。改良伊格尔培养基(Dulbecco'smodifiedEaglemedium,DMEM)培养基(GIBCOBRL公司),胎牛血清(杭州四季青公司),Trizol、逆转录试剂盒(DRR037S,大连宝生物公司),荧光定量PCR7300systerm(AppliedBiosysterms公司),DNAMarker,DL2000(西安舟鼎国生物技术有限公司,乳酸脱氢酶(lacticdehydrogenase,LDH)(南京建成),牛血清白蛋白(Spain公司),兔抗小鼠c-fos(Abcam公司),PCR扩增仪(MG96G,LongGene公司),CO2细胞培养箱(ThermoRevco,USA),倒置相差显微镜(OLYMPUS,Japan),紫外分光光度计,台式高速冷冻离心机(Heraeus,German)。二、方法取处于对数生长期的PC12细胞以3~5106/ml分别接种于96孔板及6孔板(放有经多聚赖氨酸处理过的载玻片)中,经37、5%CO2的培养箱培养,2d后换液。实验分为对照组、模型组(自制密闭3通箱,放于培养箱中,通入氮气,待氧气压力表显示为0时,夹闭各通气管道。开始计时)、大黄酚组(模型组+大黄酚,浓度分别为1g/ml,5g/ml)。大黄酚组于造模前先给予各浓度大黄酚处理,培养12h,各组同时换液,按0,1,2,6,12,24h收取细胞,同时实验。三、显微镜观察PC12细胞形态变化取处于对数生长期的PC12细胞以3~5106/ml分别接种于96孔板及6孔板(放有经多聚赖氨酸处理过的载玻片)中,经37、5%CO2的培养箱培养,2d后换液。实验分为对照组、模型组(自制密闭3通箱,放于培养箱中,通入氮气,待氧气压力表显示为0时,夹闭各通气管道。开始计时)、大黄酚1g/ml组(模型组+大黄酚1g/ml)、大黄酚5g/ml组(模型组+大黄酚5g/ml)。大黄酚组于造模前先给予各浓度大黄酚处理,培养12h,各组同时换液,按0、1、2、6、12、24h收取细胞,同时实验。四、四甲基偶氮唑盐法(multiply-tabletournament,MTT)测定细胞活力各时间点培养结束后,吸取培养液,每孔加入5

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