一株降解烟碱烟草内生菌的筛选与鉴定

作者:申星;张娟;彭宇;王远亮 刊名:农产品加工(学刊) 上传者:刘娜

【摘要】从湖南省浏阳官渡烟草基地取2株烟草整株为菌株来源,经过分离纯化筛选出降解烟碱烟草内生菌10株。复筛得到降解烟碱能力最强内生细菌菌株T11,并对其进行菌落形态、个体形态和生理生化鉴定。利用细菌16S rDNA通用引物对其16S rDNA进行PCR扩增,16S rDNA序列及其进化树分析结果显示,该菌为芽孢杆菌。

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烟草是我国一种重要的经济农作物,烟草是含有生物碱的农作物,其生物碱主要包括烟碱、降烟碱、新烟草碱和假木贼碱4种,其中烟碱占烟草总生物碱含量的94%以上。烟碱是一种中枢神经兴奋剂,吸食后使人产生生理和心理上的依赖性,是让人成瘾的物质[1]。然而对烟草的外观以及烟叶品质有严格的要求,烟草中的烟碱含量对烟叶品质有着重要的影响。因此,如何降低烟叶中烟碱含量,提高烟叶品质与可用性已成为烟草研究人员的主要任务。可以通过农业种植[2]、化学浸提等途径来降低烟碱含量,但是这些方法的周期很长或负面作用大影响其应用。国外利用微生物降解降低烟叶中烟碱含量在多年以前就开始了研究并有丰富的经验,Brown&Williamson烟草公司利用假单胞杆菌对烟草中的烟碱进行降解,发现用假单胞杆菌菌液对白肋烟和烤烟的混合烟丝(11)进行18h处理后,烟碱含量平均从2.00%降到了0.85%,研究发现每支卷烟的烟碱含量从1.58mg降到了0.98mg[3]。王革等人从烟叶上分离出3株对烟碱具有较强降解能力的菌株。1材料与方法1.1菌株及培养基菌株T11:分离自湖南浏阳官渡烟草基地烟草植株。培养基:牛肉膏蛋白胨培养基,马铃薯葡萄糖琼脂培养基,高氏1号培养基,烟碱培养基(烟碱为唯一碳源和氮源)。1.2烟草内生菌株的分离在湖南省浏阳官渡烟草基地去取2株生长性状良好、无病虫害症状的、有代表性的健康烟草整株烟草植株,分别取其叶脉、茎、根,用无菌水处理干净,分别取其的前中后3段,分别放入体积分数75%的乙醇中浸泡5min,用无菌滤纸擦干;去除外表皮切成薄片;用无菌镊子将薄片放到3种培养基的表面,每个平板放6片。将平板分别放置于37与28的培养箱中培养,细菌培养1d,霉菌培养2d,放线菌培养3d[4]。将初筛得到的纯菌株分别接入装有5mL液体烟碱培养基的试管中,摇床振荡培养2d,制备菌液。再将各菌株菌液加入装有50mL液体烟碱培养基的三角瓶中,每菌株2个平行,于30,200r/min的摇床振荡培养,以50mL未加烟碱的液体培养基作为空白,每2d测1次培养液中的烟碱含量,判定菌株降解烟碱的能力[5]。对其菌落特征进行观察,挑取单个菌落制片,进行革兰氏染,观察其个体形态。1.316SrDNA的PCR扩增及序列测定DNA提取方法参见《分子克隆实验指南》,16SrDNA基因片段的扩增:采用细菌通用引物(源于E.coli16SrRNA基因序列保守区域的两段引物)1492R和27F,分别用灭菌去离子水稀释到10pmol/L后使用。正向引物为27F:5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3';反向引物1492R:5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'[6],对菌株T11总DNA进行16SrDNA的PCR扩增。PCR反应体系:无菌超纯水36.4L,10buffer(含Mg2)+5.0L,dNTP(2.5mmol/L)1.6L,引物1(1492R,10PM)2.0L,引物2(27F,10mol/L),2.0L,DNA模板2.0L,TaqDNA聚合酶(2.0/mL)2.0L,总体积50.0L。反应参数:95预变性4min;95变性40s,54退火50s,72延伸2min,30个循环;72延伸10min。用1%的琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物,用溴化乙啶(EB)染色后在凝胶成像仪观察PCR产物条带,然后将PCR产物送上海生物工程技术有限公司测序。1.4系统发育学关系分析打开clustalX,载入上述序列,设置相关参数,将所测得的序列在NCBI上进行比对,选取序列保存为text格式,运行Bioe

参考文献

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