广西巴马小型猪ApoE基因真核表达载体的构建及鉴定

作者:苏秀珍;蒋钦杨;陈少梅;郭亚芬;兰干球 刊名:南方农业学报 上传者:王晓芳

【摘要】【目的】构建广西巴马小型猪载脂蛋白E基因(ApoE)真核表达载体,为生产转ApoE基因的广西巴马小型猪奠定基础。【方法】采用RT-PCR从广西巴马小型猪肝组织中扩增出ApoE基因编码序列,将该基因连接至pEGFP-C1载体上,利用双酶切和测序对重组质粒pEGFP-C1-ApoE进行鉴定,并将重组质粒pEGFP-C1-ApoE转染PK15细胞。【结果】广西巴马小型猪ApoE基因编码区序列长954bp,编码317个氨基酸,与GenBank已公布的猪ApoE基因cDNA序列(NM_214308)对应区段同源性为100%。构建的重组质粒pEGFP-C1-ApoE转染PK15细胞48h后,在荧光显微镜下转染细胞发出荧光,细胞形态清晰,可见细胞核。【结论】广西巴马小型猪ApoE基因能与pEGFP-C1载体重组构建pEGFP-C1-ApoE真核表达载体,有效表达出ApoE蛋白。

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0引言【研究意义】阿尔茨海默病(Alzheimer’sdisease,AD)俗称老年痴呆症,是严重影响老年人身心健康的主要疾病之一,目前我国患AD的人数高达600万人,居世界第一。AD是由遗传因素和环境因素共同作用所形成,其中遗传因素在AD尤其家族性AD的发病中起重要作用(杜琳,2008)。现已确定与早发性AD相关的基因有淀粉样前体蛋白基因、早老素1基因和早老素2基因,但唯一确定与散发性、迟发性AD关系最密切的仅有载脂蛋白E基因(ApoE)(朱长乐等,2007;齐玉晶和石胜良,2011)。因此,通过对ApoE基因分型可以早期诊断AD及预测患病风险,有助于临床治疗方案的选择。【前人研究进展】ApoE基因参与老年斑和神经原纤维缠结的形成(RefoloandFillit,2004)。人类ApoE基因含有4个外显子和3个内含子,全长3.7kb;根据其外显子4中引起第112、158位氨基酸突变的两个常见多态性位点,可将ApoE基因区分为2、3和43个等位基因并构成6种基因型(Dasetal.,1985)。其中,等位基因4是我国人群AD病危险基因,而3是保护基因(张耀东等,2011)。长白猪ApoE基因在不同组织中均有表达,以肝脏和脑组织表达量较高;此外,ApoE外显子4的第227位多态性可影响母猪的利用年限(李仕新等,2010,2011)。转基因动物模型是研究AD病发生机制及新药物研制、疾病诊疗的重要载体。目前,已经有携带ApoE基因的转基因小鼠AD模型销售,但转ApoE基因的猪AD模型尚无文献报道。【本研究切入点】猪在遗传距离、生理生化指标及心血管系统等方面比鼠类更接近于人类,因此,转基因猪疾病模型是研究人类疾病发生机制和新药研发的理想动物模型。广西巴马小型猪个体矮小,易于实验操作,组织器官大小和解剖学特性与人类相似,是制作人类疾病模型的理想实验动物,但有关广西巴马小型猪ApoE基因的研究未见报道。【拟解决的关键问题】克隆广西巴马小型猪ApoE基因,连接至真核表达载体后转染细胞以验证载体的可行性,为下一步生产转ApoE基因的广西巴马小型猪奠定基础。1材料与方法1.1试验材料广西巴马小型猪的肝脏组织由广西大学广西巴马小型猪原种保种场提供。Trizol试剂、大肠杆菌DH5购自北京天根生化科技有限公司,M-MLV逆转录酶、pMD18-T载体、XhoI酶、SalI酶、T4连接酶等购自TaKaRa公司,pEGFP-C1载体、PK15细胞由广西大学动物遗传育种实验室保存提供;琼脂糖凝胶回收纯化试剂盒、质粒DNA提取试剂盒购自BioFlux公司;脂质体2000购自Invitrogen公司;无内毒素的质粒大量抽提试剂盒购自OMEGA公司。1.2RT-PCR扩增ApoE基因的cDNA根据GenBank已发布的猪ApoE基因cDNA序列(NM_214308)及引物设计原则,利用Oligo6.0软件设计1对特异性引物(上游:5'-CTCGAGTTATGAGGGTTCTGTGGGT-3',25bp;下游:5'-TCACTGATTATCACTGGGC-3',19bp),上、下游引物跨越长度包括ApoE基因的整个编码序列,其中上游还插入XhoI酶切位点(划线部分)。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。利用Trizol法提取广西巴马小型猪肝组织总RNA,经逆转录合成cDNA,然后根据上述引物进行PCR扩增,扩增程序为:94预变性5min;9430s,54,30s,721min,进行34个循环;72延伸5min;4保存。按胶回收试剂盒说明将PCR产物进行回收纯化。1.3连接pMD18-

参考文献

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